单核细胞增生性李斯特菌srtA基因缺失株的构建及其部分生物学特性研究

发布时间：2017-03-24 01:15

  本文关键词：单核细胞增生性李斯特菌srtA基因缺失株的构建及其部分生物学特性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：单核细胞增多性李斯特菌(listeria monocytogenes,LM)作为四大重要食源性病原菌之一,对人类及多种畜禽健康威胁极大,可以突破宿主的肠道屏障,血脑屏障和血胎屏障,临床上引起肠胃炎、脑膜脑炎、败血症、流产等症状,尤其是对幼龄和妊娠母畜,发病急,死亡率高。LM细胞胞壁表面分布多种毒力蛋白,在感染机体过程中发挥重要作用,其中有一类至关重要的表面蛋白的前体蛋白C端含有保守基序LPXTG,Srt A是一种分选酶能够识别表面蛋白C末端的保守基序LPXTG,共价结合到肽聚糖上,呈现在细胞表面发挥毒力作用,是毒力蛋白可以锚定到细菌细胞壁过程中的关键。本研究以李斯特菌病绵羊脑组织临床分离的单核细胞增多性李斯特菌(简称LM90SB2,4b血清型)为研究对象,首先对LM90SB2的srt A基因进行序列分析及原核表达;构建LM90SB2的srt A基因缺失株(LM90SB2-△srt A),对比分析生化特性,生长特性,对小鼠和不同种属类型细胞的毒力等生物学功能,为探究LM的Srt A分选的蛋白谱,寻找新的毒力蛋白研究奠定了重要基础;在LM致病机理研究中和药物靶标的筛选上同样具有重要作用。1.LM90SB2 srt A基因的序列分析与原核表达:为了探究LM90SB2的srt A基因的特异性及其在原核表达质粒p ET32a中的表达。利用PCR技术扩增LM90SB2的srt A基因,测序后用DANMAN软件与已公布的标准株进行序列比对分析,将srt A克隆到原核表达质粒p ET32a中构成重组表达质粒p ET32a-srt A。质粒p ET32a-srt A转化到蛋白表达菌株E.coli BL21(DE3)中,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导使其表达,SDS-PAGE电泳检测,同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。实验结果表明:LM90SB2与标准株LMF2365(serovar 4b,NC_002973)srt A基因的核苷酸同源性为100%;Srt A蛋白在BL21(DE3)中大量表达,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测分析其为一个分子量为47k D的融合蛋白与预期的大小相符合。2.LM90SB2 srt A基因缺失株(LM90SB2-△srt A)的构建与鉴定:基因缺失是研究基因功能常用的方法,本实验利用同源重组的方法构建LM90SB2 srt A基因缺失株(LM90SB2-△srt A),为研究LM的srt A基因的功能奠定基础。用Primer 5.0软件设计融合引物,PCR扩增LM90SB2 srt A基因的上下游同源臂,运用融合PCR(SOE-PCR)的方法连接上下臂获得缺失srt A基因的同源片段(△srt A),连接到p MD19-T构成p MD19-T-△srt A,基因测序结果正确后将△srt A克隆到质粒p KSV7中构成重组质粒p KSV7-△srt A。将质粒p KSV7-△srt A电转化入LM90SB2中,筛选阳性克隆,在高温和10μg/ml氯霉素抗性条件下连续传代,发生同源重组,用两对引物(srt AF1和srt AR2,srt AF和srt AR)PCR验证缺失片段。再置于无抗性的30℃条件下连续传代获得稳定的srt A基因缺失株LM90SB2-△srt A。在无氯霉素抗性的BHI液体培养基中,37℃,180 rpm条件下连续传代培养20代,PCR检测无毒力返祖现象,表明该缺失株具有良好的遗传稳定性。3.对比分析LM90SB2-△srt A部分生物学特性:对比分析缺失株LM90SB2-△srt A与野生株LM90SB2的部分生物学特性的差异,来探究srt A基因对于LM90SB2毒力的影响。本实验主要对比分析了细菌的生化特性、溶血效价、耐酸耐碱性、生物膜形成能力;对于MBMEC,HBMEC,RAW264.7,SIEC的粘附,侵袭和胞内增殖能力以及对BALB/c小鼠的致病能力影响。结果表明:srt A基因的缺失后,LM90SB2的生化特性、耐酸耐碱性无变化;溶血效价、生物膜形成能力稍有差异;LM90SB2对不同细胞的粘附、侵袭和胞内增殖能力不同,对RAW264.7的感染效率最高,对脑细胞的感染效率相对较低;srt A基因缺失后显著降低了LM90SB2对HBMEC,RAW264.7,SIEC细胞的粘附率和对MBMEC,RAW264.7,SIEC细胞的侵袭率(P0.05),对LM90SB2在MBMEC,HBMEC,RAW264.7,SIEC中的增殖趋势未有明显影响,但细菌含量有所降低;srt A基因缺失后LM90SB2对BALB/c雌性小鼠的LD50值升高了1.63个对数级,在感染了4天后小鼠的肝脏、脾脏和脑中的含菌量有所降低。表明srt A基因缺失后LM90SB2对细菌和细胞的侵染能力有所下降。
【关键词】：单核细胞增多性李斯特菌 原核表达 同源重组 基因缺失 生物学特性
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61;R378
【目录】：

• 全文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文缩略词表12-13
• 引言13-14
• 第一章 文献综述14-27
• 1. LM的一般特性14-18
• 1.1 LM的生物学特征14-15
• 1.2 LM的流行病学特征15-16
• 1.3 李斯特菌病的临床症状16
• 1.4 李斯特菌病的诊断与防治16-18
• 2. LM的毒力因子及致病机制18-24
• 2.1 LM侵入细胞相关的主要毒力因子19-22
• 2.2 LM的毒力调控因子22-24
• 3.分选酶的研究进展24-27
• 3.1 分选酶的结构与功能24-25
• 3.2 LM的分选酶蛋白25
• 3.3 分选酶的应用前景25-27
• 第二章 试验部分27-59
• 实验一 LM90SB2 srtA基因序列分析及原核表达27-35
• 摘要27-28
• 1.材料28
• 1.1 菌株、质粒及引物28
• 1.2 主要试剂和仪器28
• 2.方法28-31
• 2.1 LM90SB2基因组DNA的制备及srtA基因的扩增28-29
• 2.2 E.coli DH5α、BL21（DE3）感受态细胞的制备（CaCl2）29
• 2.3 srtA基因与pMD19-T的连接29-30
• 2.4 重组原核表达质粒pET32a-srtA的构建30
• 2.5 srtA基因在E.coli BL21（DE3）中的表达30
• 2.6 Western-blotting鉴定重组蛋白30-31
• 3.结果31-34
• 3.1 LM90SB2 srtA基因的克隆及序列分析31
• 3.2 原核表达质粒pET32a-srtA的鉴定31-32
• 3.3 srtA基因在E.coli BL21（DE3）中表达产物SDS-PAGE分析结果32-33
• 3.4 表达产物Western-blotting分析结果33-34
• 4.讨论34-35
• 实验二 LM90SB2-△srtA缺失株的构建35-47
• 摘要35
• 1.材料35-37
• 1.1 菌株、质粒及引物35-36
• 1.2 主要试剂与仪器36-37
• 2.方法37-40
• 2.1 srtA基因上下游同源臂的扩增及SOE-PCR37-38
• 2.2 融合同源臂△srtA与pMD19-T的连接38
• 2.3 重组穿梭质粒pKSV7-△srtA的构建38
• 2.4 电转用LM 90SB2感受态细胞的制备38-39
• 2.5 pKSV7-△srtA质粒电转化到LM90SB2感受态细胞中39
• 2.6 同源重组39-40
• 2.7 LM90SB2-△srtA基因缺失株的遗传稳定性鉴定及生长特性40
• 3.结果40-46
• 3.1 srtA基因上下游同源臂的扩增和SOE-PCR结果40-41
• 3.2 重组质粒pMD19-T-△srtA和pKSV7-△srtA酶切鉴定结果41-42
• 3.3 电转后阳性转化子的鉴定42-43
• 3.4 同源重组结果的筛选与鉴定43-45
• 3.5 LM90SB2-△srtA缺失株鉴定及遗传稳定性分析和生长曲线测定结果45-46
• 4.讨论46-47
• 实验三 LM90SB2-△srtA缺失株部分生物学特性研究47-59
• 摘要47
• 1.材料47-48
• 1.1 菌株、细胞和实验动物47-48
• 1.2 主要试剂和仪器48
• 2.方法48-51
• 2.1 生化特性鉴定48-49
• 2.2 溶血效价的测定49
• 2.3 耐酸耐碱生长曲线测定49
• 2.4 生物膜形成能力的测定49-50
• 2.5 对MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC的粘附、侵袭和胞内增殖实验50
• 2.6 LD50的测定50-51
• 2.7 感染小鼠后肝、脾、脑载菌量的测定51
• 3.结果51-57
• 3.1 生化鉴定结果51
• 3.2 溶血效价的测定结果51-52
• 3.3 耐酸耐碱生长曲线52
• 3.4 生物膜形成能力的测定结果52-53
• 3.5 对MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC的粘附率、侵袭率和胞内增殖能力53-55
• 3.6 LD50的测定结果55
• 3.7 感染小鼠后肝、脾、脑载菌量的测定结果55-57
• 4.讨论57-59
• 全文结论59
• 主要创新点59-60
• 参考文献60-68
• 附录68-70
• 致谢70-71
• 作者简介71-72
• 附件72

【参考文献】

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本文编号：264885