应用MDCK细胞表达流感减毒活疫苗（LAIV）和应用鸡胚检测病毒滴度方法学验证的研究

发布时间：2017-03-24 06:07

  本文关键词：应用MDCK细胞表达流感减毒活疫苗（LAIV）和应用鸡胚检测病毒滴度方法学验证的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究采用Cytodex3微载体,以MDCK细胞作为流感病毒生产基质,探索了H1N1(A/17/California/2009/38)型流感病毒以及B (B/56/Brisbane/60/08)型流感病毒最适增殖条件。采用正交设计的方法,考察TPCK胰酶浓度、病毒培养液pH以及病毒感染复数MOI对Cytodex3微载体上MDCK细胞生长的流感病毒滴度的影响。通过以上研究,确定了TPCK胰酶终浓度为1.0μg/ml,病毒培养液pH7.2,病毒感染复数MOI为0.1作为流感病毒最佳培养参数。为了考察生物反应器表达流感病毒的重复性,采用上述培养参数行了两次实验,HIN1及B型流感减毒株均在接种后72小时达到病毒滴度峰值,到达峰值时,HIN1及B型流感病毒滴度均值可分别达到7.6±0.151gEID50及7.1±0.261gEID50,并且此浓度TPCK-胰酶对MDCK细胞无明显损伤。市售流感疫苗主要以鸡胚为基质生产,但是鸡胚中存在的卵清蛋白可能引起过敏反应,病毒在鸡胚连续传代后,病毒容易发生变异,使其不能与人群中的流行毒株完全匹配。为此世界卫生组织鼓励生产厂家开发以哺乳动物细胞为基质生产的流感疫苗。本实验以MDCK细胞为生产基质,选择微载体培养方式,通过正交实验设计,以期实现缩短培养时间、提高生产效率、提高病毒产量的目的,为大规模流感疫苗生产提供了依据。 流感减毒活疫苗(LAIV)系在鸡胚中生产,并按照比例将H1N1型(A/17/California/2009/38)、 H3N2型(A/17/Perth/09/87)和B(B/56/Brisbane/60/08)型流感减毒活疫苗株配制成三价疫苗。本研究初步建立了采用MDCK细胞培养流感减毒活疫苗的工艺参数。当采用哺乳动物细胞生产流感疫苗时,由于病毒株已经适应了哺乳动物的生长条件,细胞法检测结果可能与鸡胚法存在差异。因此,本研究验证了鸡胚法(EID5o)检测以MDCK细胞为基质生产的流感减毒活疫苗滴度的适用性。对其专属性、线性、准确度、精密度、重复性、耐用性等方面进行了方法学验证。结果表明,EID50方法具有高度特异性,同种型别中和抗体均可以有效地中和同种流感病毒,并且异种中和抗体不干扰病毒滴度的测定,制剂辅料对流感病毒滴度检测结果无影响；方法线性良好,在线性范围内,三种型别病毒的线性回归系数(R2)在0.994～0.999之间；日间精密度的RSD值在1.65%-2.58%之间,平均回收率在97.3%～103.8%之间。采用EID50方法检测以细胞为基质生产的三价流感减毒活疫苗病毒滴度,具有较高的可信性,能够满足流感疫苗生产厂家评价疫苗效力的需求。对于了解每种型别病毒稳定性、免疫原性具有重要的意义。 为了考察鸡胚法(EID50)及细胞法(TCIDso)检测以细胞为基质生产的流感病毒滴度的相关性,本研究分别采用TCID50及EID50两种方法检测A/17/California/2009/38、 A/17/Perth/09/87以及B/56/Brisbane/60/08三种型别流感病毒滴度。结果表明：TCID50法测定A/17/California/2009/38、 A/17/Perth/09/87以及B/56/Brisbane/60/08型流感病毒滴度(平均值±SD)分别为7.2±0.151gTCID50、7.5±0.171gTCID50及7.0±0.101gTCID50;EID50法测定结果分别为7.3±0.201gEID50、7.5±0.151gEID50及7.0±0.121gEID50;两种方法检测结果间未见无显著性差异(P0.05),表明可以作为流感病毒滴度测定的替代方法。
【关键词】：流感减毒活疫苗 微载体 MDCK TCID50 EID50 分析方法验证
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩略词表11-12
• 第一章 绪论12-27
• 1.1 流感病毒概述12-16
• 1.2 流感疫苗概述16-23
• 1.3 生产流感病毒疫苗常用基质23-26
• 1.4 立题依据及研究目标26-27
• 第二章 采用MDCK细胞培养流感病毒方法的建立27-37
• 2.1 材料与仪器27
• 2.1.1 药品与试剂27
• 2.1.2 仪器设备27
• 2.2 实验方法27-30
• 2.2.1 细胞复苏27-28
• 2.2.2 细胞传代及病毒接种28
• 2.2.3 微载体培养28-29
• 2.2.4 培养条件优化(流感病毒培养条件优化)29
• 2.2.5 流感病毒滴度测定(EID50法)29-30
• 2.3 实验结果30-34
• 2.3.1 H1N1型流感病毒培养条件优化结果30-32
• 2.3.2 B型流感病毒培养条件优化结果32-33
• 2.3.3 H1N1及B型流感病毒培养条件评价33-34
• 2.4 讨论34-36
• 2.5 结论36-37
• 第三章 流感病毒滴度测定方法鸡胚法(EID_(50))的验证37-51
• 3.1 材料与仪器37
• 3.1.1 药品与试剂37
• 3.1.2 仪器37
• 3.2 实验方法37-43
• 3.2.1 流感病毒滴度测定(EID50法)37
• 3.2.2 检验方法验证37-43
• 3.2.2.1 样品处理37-39
• 3.2.2.2 专属性39-40
• 3.2.2.3 线性40-41
• 3.2.2.4 准确度41
• 3.2.2.5 精密度41-42
• 3.2.2.6 耐用性42-43
• 3.3 结果43-49
• 3.3.1 专属性43-45
• 3.3.2 线性45-46
• 3.3.3 准确度46-47
• 3.3.4 精密度47-49
• 3.3.5 耐用性49
• 3.4. 讨论49-50
• 3.5 结论50-51
• 第四章 EID_(50)法和TCID_(50)法测定结果相关性研究51-56
• 4.1 材料与仪器51
• 4.1.1 药品与试剂51
• 4.1.2 仪器51
• 4.2 实验方法51-54
• 4.2.1 细胞复苏52
• 4.2.2 细胞传代52
• 4.2.3 铺96孔培养板52
• 4.2.4 感染52-53
• 4.2.5 病毒培养53
• 4.2.6 CPE检测53-54
• 4.2.7 结果处理54
• 4.2.8 EID50法54
• 4.3 结果54-55
• 4.4 讨论55
• 4.5 结论55-56
• 参考文献56-60
• 附录实验用液体配制60-62
• 致谢62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 樊庆帅;牛红星;吴书军;张旭;谭文松;;无血清培养MDCK细胞生产狂犬病病毒条件的初步优化[J];中国生物制品学杂志;2009年11期

2 宋绍辉;李卫东;廖国阳;马娜;杨佳;梁海孝;杨耀云;马忠飞;;TritonX-100裂解流感病毒的研究[J];云南大学学报(自然科学版);2009年05期

3 刘丽玲;王秀荣;陈化兰;田国彬;孙凯;魏萍;;不同亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的生长特性[J];中国兽医杂志;2006年10期

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