我国结膜吸吮线虫分离株的鉴定及遗传多态性研究

发布时间：2020-05-09 15:53

【摘要】：结膜吸吮线虫,可寄生于家畜、野生食肉动物及人的结膜囊内,导致结膜吸吮线虫病,主要表现为结膜炎,结膜充血,泪腺分泌物增加,严重者可出现角膜溃疡,甚至失明。1910年在印度犬的结膜囊内首次发现结膜吸吮线虫,1917年在我国的北京和福州首次发现人感染病例。目前,世界多地均有结膜吸吮线虫病的报道,但大多数病例出现在亚洲的东部和东南部地区,因此结膜吸吮线虫又称为东方眼虫。我国是结膜吸吮线虫感染病例最多的国家,已有超过600例病例报道。近年来,结膜吸吮线虫病发病数在我国部分地区呈上升趋势,已经成为新现的动物源性寄生虫病。尽管我国多地存在结膜吸吮线虫病的威胁,但有关结膜吸吮线虫的系统性鉴定及遗传多态性研究仍比较薄弱,本研究首先对我国3例结膜吸吮线虫临床分离株进行形态学鉴定,并对其线粒体基因组进行重测序,然后对我国11个地区的虫体分离株进行遗传多态性分析,为结膜吸吮线虫病的预防及控制策略奠定基础。材料与方法1结膜吸吮线虫的鉴定:分别使用光学显微镜和扫描电镜对我国中部地区的三条结膜吸吮线虫临床分离株进行观察,并对关键形态部位进行拍照、描述和记录,根据分类检索表,对其进行物种鉴定。2线粒体基因组的测序及组装:使用长PCR扩增法对结膜吸吮线虫的线粒体基因组进行扩增,在Illumina HiSeq 2000平台上进行高通量测序。然后使用FastQC v.0.11.5软件对原始的测序读长进行质量评价,接着使用CLC Genomic Workbench v.7.0.4软件将这些修饰过的序列标注到结膜吸吮线虫两个参考线粒体组(NC_018363和AP017700)序列上。最后,使用MITOS对线粒体基因进行注释,并提交至GenBnak数据库。3结膜吸吮线虫种群的遗传多态性分析:选用五个分子标记:cytb、cox1、12S rDNA、ITS1和18S rDNA对结膜吸吮线虫的遗传多样性进行分析。使用DnaSP v5.10软件估算每个分子标记的单倍型数量、单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)。单倍型之间的中介连接网络关系使用Network v5.0软件进行绘制。种群之间的遗传差异性水平用F_(ST)值进行评估。使用Arlequin程序中的岐点分布分析来估计结膜吸吮线虫种群结构变化。同样使用Arlequin程序中的Tajima’s D检验和Fu’s F_S检验推断种群是否发生过种群扩张。此外,基于cox1序列比较全球不同地区不同宿主结膜吸吮线虫分离株间的遗传差异。4系统发育分析:分别用最大简约法(MP)和贝叶斯法(BI)进行结膜吸吮线虫cox1单倍型的系统发育模式分析。MP分析在PAUP*4b10中进行,BI分析在MrBayes v3.2中进行。结果1结膜吸吮线虫形态特征:观察到雌虫的主要特征有:结膜吸吮线虫特有的口囊特征;在虫体后半部,子宫内中充满未成熟的卵和生殖细胞;虫体前部横向条纹的角质层比尾端更明显;包含短瓣结构的阴门位于虫体的前部。雄虫的主要特征有:和雌虫相比,雄虫的口囊不明显,口腔张开时呈圆形或椭圆形,雄虫有两个不同的交合刺,左边的较长,右边较短呈典型的月牙型,虫体尾端弯曲,雄虫尾部有5对乳状突起。2结膜吸吮线虫线粒体组的特征及比较:结膜吸吮线虫线粒体基因组具有12个PCGs、22个tRNA基因和2个rRNA基因。所有基因的排列顺序及蛋白基因编码方向与长度均相同。在线粒体基因中,一些基因存在重叠区域。22个tRNA基因长度范围在53到66个碱基之间。在cox3和丙氨酸(trnA)基因之间,存在一段较长(316 bp)的非编码区。来自不同地区的结膜吸吮线虫线粒体基因组序列的相似性为98.22%。蛋白编码基因序列之间相似性最高的是nad4L,最低的是atp6。氨基酸序列相似性最高的为cox1,最低的是nad6。线粒体核糖体大小亚基rDNA的序列相似性分别为89.95%和96.71%。3结膜吸吮线虫分离株的多态性及遗传差异比较:我国11个地区的32个结膜吸吮线虫临床分离株中具有较高的遗传多态性。全球不同地区的cox1基因共鉴定出21个单倍型,欧洲国家的结膜吸吮线虫均为Hap1,结膜吸吮线虫Haps2 8和haps10 12主要存在于犬分离株中。Hap9和haps13 21主要存在于临床分离株中。21个单倍型的比对发现37处核苷酸变异。种群差异性分析结果显示,欧洲和亚洲国家种群的差别大于中国,韩国,日本种群间的差别。中性检测及岐点分布分析结果均不支持结膜吸吮线虫种群存在扩张效应。4系统发育重建:在旋尾目线虫中,颚体科与龙线科+嗜子宫科+泡翼科+吸吮科+筒线科+丝状科+盘尾丝虫科组成的分枝是姊妹类群。在较大的分枝中,最早分化出来的是龙线虫科和嗜子宫科。盘尾丝虫科作为一个单系分支,是最晚分化出来的。来自欧洲和亚洲国家的结膜吸吮线虫种群被分成两个亚群,这两个种群在更新世中期开始分化。结论1基于光镜和电镜的形态特征,所有的临床分离株均被鉴定为结膜吸吮线虫。2在结膜吸吮线虫线粒体基因中,nad6基因显示出较高的序列变异,可作为结膜吸吮线虫种群遗传学研究的靶基因。3在cox1序列中有5个核苷酸位点可以将结膜吸吮线虫欧洲和亚洲分离株进行区分。欧洲和亚洲种群的遗传差异要大于中国,韩国,日本等亚洲国家种群之间的差别。4欧洲和亚洲的结膜吸吮线虫种群可以分为两个亚群,且这两个亚群在更新世中期开始分化。5系统发育分析显示吸吮科、盘尾丝虫科、丝状科、筒线科、泡翼科、龙线科和嗜子宫科的亲缘关系较近。
【图文】：

序列,结膜吸吮线虫,局部特征,虫体

图 4.1 结膜吸吮线虫虫体局部特征注释：Fa：雌虫口囊；Fb：子宫后半段未成熟卵或生殖细胞；Fc 和 Fd：尾感器和肛Fe：表皮角质层；Ff：雌虫阴门；Ma：雄虫口囊；Mc:雄虫交合刺；Md：雄虫圆形圆形的口囊；Me：雄虫交合刺；Mf：雄虫尾端五对尾感器。4.3 线粒体组的特征及比较结膜吸吮线虫分离株HeN-LY1，HeN-PDS1和HeN-ZZ1分别有961 424，961 094和104个序列读长及162 140 093，166 174 524和162 301 339个碱基被回帖到线粒体基上，详细信息见表4.1。表 4.1 Illumina 测序结膜吸吮线虫线粒体基因组的组装和序列统计样本线粒体基因长度(bp)序列长度*(bp) 碱基 Q20(%) GC(%)N#(ppm)HeN-LY1 13668 961424 168.65 162140093 97.41 26.41 19.03HeN-PDS1 13667 961094 172.90 166174524 97.63 26.97 16.01HeN-ZZ1 13668 970104 168.72 162301339 97.69 25.36 18.59*读取的平均长度；#每百万分之一碱基；Q20 表示误差概率为 1%。分别对三个新的线粒体基因组序列进行了注释，每个线粒体基因组都具有PCGs、22个tRNA基因和2个rRNA基因。所有基因的排列顺序及编码方向均相同，

序列,结膜吸吮线虫,线粒体基因,重叠区域

分别对三个新的线粒体基因组序列进行了注释，每个线粒体基因组都具有12个PCGs、22个tRNA基因和2个rRNA基因。所有基因的排列顺序及编码方向均相同，并且HeN-LY1，HeN-PDS1和HeN-ZZ1三个线粒体组的蛋白编码基因的长度均相同(图4.2 )。图 4.2 结膜吸吮线虫线粒体基因注释在线粒体基因中，，一些基因存在重叠区域，如：nad6/trnR，有9 bp序列重合，rnL1/cox3(3 bp)，trnL2/trnN (11 bp)，nad1/trnF (32 bp)，cox2/trnH (10 bp)，rrnL/nad3 (8 bp)
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R383.1

【参考文献】