MiR-24-3p靶向Pink1调节帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元损伤

发布时间：2020-05-10 07:38

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是目前仅次于阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD)的全球第二大神经退行性疾病,其主要病理特征包括中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性丢失、神经元中路易小体(Lewy body)沉积以及胶质细胞活化。PD病人临床表现包括静止性震颤、肌肉僵直和运动障碍等。目前的研究认为兴奋性毒性、氧化应激、线粒体功能障碍及神经炎症等在PD的病理进程中发挥重要的作用,然而确切的发病机制至今尚未阐明。虽然发病机制的多样性制约着PD治疗学的发展,但找寻能够缓解多巴胺能神经元进行性退变的分子靶标,一直是研发理想PD治疗药物的重要目标。近年来的研究表明,线粒体功能障碍是PD中导致DA神经元死亡的重要原因。神经细胞线粒体功能障碍会直接影响脑内能量代谢,并且造成活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)的大量产生,加重氧化应激。此外,受损线粒体还会释放凋亡诱导因子,激活凋亡通路,从而诱导神经元凋亡。Pink1(PTEN induced putative kinase 1)是帕金森病发病的关键基因之一,其突变会导致早发性常染色体隐性遗传帕金森综合征(autosomal recessive early-onset Parkinson's disease),它同时也是与线粒体功能密切相关的一个基因。Pink1蛋白由581个氨基酸构成,包含线粒体目标信号和跨膜序列,是一种靶向于线粒体的的丝/苏氨酸蛋白激酶。大量研究表明,Pink1在维持细胞线粒体功能和稳态、促进线粒体自噬(Mitophagy)、保护细胞免受氧化应激诱导的凋亡等方面发挥重要的作用,基因敲除Pink1会导致线粒体功能受损,而线粒体功能紊乱引起的神经突触退化、神经元萎缩甚至凋亡在PD的发生发展中起到了重要的作用。因此,通过调节Pink1的表达来改善线粒体功能可能是一种有效对抗PD的神经保护策略。然而Pink1的转录后调控机制及其在PD发生发展中的作用目前仍鲜有报道。MicroRNA(miRNA)是一类在细胞中高度保守并且不具有编码蛋白质功能的小分子单链RNA,其长度一般为20～25个核苷酸并广泛存在于真核生物中,主要通过与靶基因mRNA的3'UTR(3'端非翻译区,3'untranslatedregion)互补配对从而发挥在转录后水平抑制蛋白表达的功能。据统计,人体内超过三分之一可编码蛋白质的基因都受到miRNA的调控,并且已发现miRNA参与了细胞增殖和凋亡、激素的分泌、肿瘤形成以及神经退行性疾病等生理病理过程。越来越多的研究表明,miRNA异常表达在PD的病理进程中发挥重要作用,其可能成为PD早期诊断的一种生物标志物,亦或许可通过调控miRNA的表达来达到延缓PD病理进程的目的。MiR-24-3p是miRNA家族中重要的一员,在哺乳动物的各种组织中广泛表达,主要参与调节肿瘤细胞的增殖与凋亡,且其在不同肿瘤细胞的生长过程中所展现的作用各不相同。有研究表明PD患者血浆中miR-24-3p的表达与正常人相比显著升高,提示miR-24-3p可能与PD的发生发展相关,然而目前还没有关于miR-24-3p在PD中具体作用的报导。因此,本文首先证明了 miR-24-3p靶向调节Pink1的表达。在此基础上,通过离体和在体实验研究miR-24-3p/Pink1转录后调控对MPTP/MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤和凋亡的影响及其机制。离体研究结果表明,miR-24-3p mimic抑制Pink1的表达且加剧MPP+引起的SH-SY5Y细胞损伤,而miR-24-3p inhibitor显著抑制MPP+诱导的细胞毒性损伤和凋亡通路的激活;进一步的研究阐明了miR-24-3p inhibitor通过促进损伤线粒体清除、改善线粒体功能,发挥细胞保护作用的机制。最后我们对miR-24-3p inihbitor的神经保护作用进行了在体验证:中脑立体定位注射miR-24-3p antagomir显著减轻MPTP诱导的A53Ttg/tg小鼠黑质致密部多巴胺能神经元损伤并减少A53Ttg/tg小鼠中脑α-synuclein蛋白聚积,同时上调A53Ttg/tg小鼠中脑自噬水平。本课题揭示了 miR-24-3p在PD病理进程中的作用并阐明其机制,为靶向miR-24-3p/Pink1转录后调控发展PD治疗新策略提供了实验依据。目的:研究miR-24-3p/Pink1转录后调控对PD模型小鼠多巴胺能神经元损伤的影响及机制。方法:(1)C57BL/6J小鼠制备MPTP亚急性PD模型后免疫印迹(Western Blot,WB)检测中脑Pink1蛋白表达、实时荧光定量PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测中脑miR-24-3p表达,培养SH-SY5Y细胞并给予不同浓度(0、100、200、400 μM)的MPP+刺激,WB检测细胞Pink1蛋白表达、RT-PCR检测细胞miR-24-3p表达;(2)使用10月龄经CRISPR-Cas9技术构建的全身性Pink1基因敲除(Pink1-1-)大鼠,通过免疫组织化学法对其黑质中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞进行定量分析;(3)通过生物信息学分析结合文献报导推测可能靶向Pink1并参与PD病理进程的miRNA,RT-PCR检测它们在MPTP亚急性PD模型小鼠中脑组织内的表达,筛选出最有可能转录后调节Pink1 表达的 miRNA(miR-24-3p);构建 miR-24-3p 模拟物(miR-24-3p mimic)和miR-24-3p 抑制剂(miR-24-3p inhibitor),转染 SH-SY5Y 细胞,Western Blot 检测Pink1蛋白表达,构建野生型与突变型Pink1 mRNA3'UTR质粒,与miR-24-3p mimic共转入HEK-293T细胞,荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性;(4)SH-SY5Y 细胞转染 miR-24-3p mimic/miR-24-3p inhibitor(100 nM),给予 MPP+刺激(400 μM)后检测细胞活力及LDH释放,Annexin-V和PI双染法、Hoechst染色法检测细胞凋亡、Western Blot检测凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-9)表达;(5)SH-SY5Y 细胞共转入 GFP-LC3 质粒与 miR-24-3p inhibitor(100 nM),并使用MitoTracker Deep Red标记线粒体,免疫荧光观察miR-24-3p inhibitor对SH-SY5Y细胞线粒体自噬的影响,同时分离细胞线粒体和胞浆蛋白,WB检测线粒体和胞浆Parkin的表达;(6)SH-SY5Y细胞转染miR-24-3p inhibitor(100 nM),给予MPP+刺激(400 μM)后采用JC-1染色检测细胞线粒体膜电位,MitoSox检测细胞线粒体ROS,给予自噬抑制剂3-MA后采用流式细胞仪检测受损线粒体数量;(7)SH-SY5Y细胞转染si-Pink1(100nM)或给予自噬抑制剂3-MA,MPP+刺激(400 μM)后检测细胞活力(CCK-8)、LDH释放;(8)采用RT-PCR和WB检测A53Ttg/tg小鼠中脑miR-24-3p和Pink1表达,A53Ttg/tg小鼠中脑立体定位注射带红色荧光标记的miR-24-3p antagomir后制备MPTP亚急性PD模型,对黑质致密部焦油紫染色阳性及TH阳性细胞进行计数;Western Blot检测中脑凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-9 表达。(9)A53Ttg/tg小鼠中脑 SNc 区立体定位注射miR-24-3p antagomir后免疫荧光双标观察TH和α-synuclein共定位情况。(10)A53Ttg/tg 小鼠中脑 SNc 区立体定位注射 miR-24-3p antagomir 后 Western Blot检测自噬蛋白LC3和p62表达;免疫荧光双标观察TH和LC3共定位情况。结果:(1)MPTP亚急性PD模型小鼠中脑Pink1蛋白表达下调C57BL/6J小鼠制备MPTP亚急性PD模型后中脑Pink1蛋白表达显著降低,200、400μM MPP+刺激SH-SY5Y细胞显著下调Pink1蛋白水平。(2)Pik1基因敲除大鼠SNc区TH+神经元数目显著减少免疫组织化学法对10月龄Pink1基因敲除大鼠中脑黑质致密部TH阳性神经元进行定量分析,结果显示,基础状态下Pink1-/-大鼠与WT大鼠相比黑质致密部TH阳性细胞数减少了 43%。(3)MiR-24-3p靶向调节Pink1表达通过生物信息学网站(Targetscan,mirDIP,miRcode)预测结合文献报导推测miR-24-3p、miR-29b、miR-30b和miR-142-5p可能参与PD病理进程并靶向调节Pink1表达;C57BL/6J小鼠制备MPTP亚急性PD模型后中脑miR-24-3p表达升高,miR-29b 表达下降,miR-30b 和 miR-142-5p 表达不变,MPP+(100、200、400 μM)刺激SH-SY5Y细胞呈浓度依赖性升高miR-24-3p水平,提示miR-24-3p可能靶向调节Pink1表达;miR-24-3p mimic显著降低SH-SY5Y细胞Pink1蛋白表达(P0.01),而 miR-24-3p inhibitor 显著上调 Pink1 蛋白水平(P0.01);WT-Pink1 3'UTR质粒与miR-24-3p mimic共转入HEK-293T细胞后荧光素酶活性显著下降(P0.01),而突变型Mut-Pink1 3'UTR质粒与miR-24-3pmimic共转染后荧光素酶活性无明显变化。(4)MiR-24-3p inhibitor减轻MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤及凋亡转染 miR-24-3p inhibitor(100 nM,24 h)部分逆转 MPP+(400 μM)引起的SH-SY5Y细胞活力降低(P0.05)和LDH释放增加(P0.05),并抑制MPP+引起的细胞核固缩和凋亡通路活化;MiR-24-3pmimic(100nM,24h)进一步加剧MPP+所致细胞活力降低、LDH释放增加以及细胞凋亡。Pink1干扰RNA(si-Pink1,100nM)能取消 miR-24-3p inhibitor 的细胞保护作用。(5)MiR-24-3p inhibitor促进SH-SY5Y细胞线粒体自噬、改善线粒体功能转染miR-24-3p inhibitor(100 nM,24 h)后SH-SY5Y细胞自噬小体与线粒体共定位显著增多,胞浆Parkin蛋白水平显著下降,线粒体Parkin表达增加,表明miR-24-3p inhibitor促进SH-SY5Y细胞线粒体自噬;MPP+刺激(400 μM)显著促进SH-SY5Y细胞线粒体ROS产生、降低细胞线粒体膜电位、引起细胞线粒体损伤,下调miR-24-3p表达显著抑制MPP+引起的SH-SY5Y细胞线粒体ROS增多(P0.01)、维持细胞正常线粒体膜电位(P0.01),并减少受损线粒体数量(P0.01);自噬抑制剂3-MA(5 mM)能取消miR-24-3p inhibitor对异常线粒体的清除作用及细胞保护作用(P0.05)。(6)MiR-24-3p antagomir减轻MPTP诱导的A53Ttg/tg小鼠中脑多巴胺能神经元损伤A53Ttg/tg小鼠与WT小鼠相比中脑miR-24-3p水平显著升高(p0.05)且Pink1表达降低(P0.01);中脑立体定位注射miR-24-3p antagomir(双侧注射,每侧0.5 nmol,注射完成5天后进行后续实验)显著减轻MPTP诱导的A53Ttg/tg小鼠SNc区焦油紫染色及TH免疫阳性细胞丢失、抑制MPTP引起的中脑神经元凋亡,并减少A53Ttg/tg小鼠SNc区α-synuclein蛋白积聚。(7)MiR-24-3p antagomir上调A53Ttg/tg小鼠中脑自噬水平立体定位注射miR-24-3p antagomir显著上调A53Ttg/tg小鼠中脑LC3-II蛋白表达、促进p62降解;免疫荧光结果显示,miR-24-3p antagomir显著促进LC3蛋白与TH共定位。表明miR-24-3p antagomir显著提高A53Ttg/tg小鼠中脑多巴胺能神经元自噬水平。结论:(1)MiR-24-3p转录后调节Pink1表达。(2)MiR-24-3p inhibitor通过促进线粒体自噬、改善线粒体功能减轻MPTP/MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤。本工作的主要创新之处:(1)发现miR-24-3p靶向抑制Pink1表达,从转录后调控的新角度阐释了Pink1在MPTP/MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤中的重要作用。(2)阐明miR-24-3p inhibitor通过上调Pink1表达、促进线粒体自噬保护多巴胺能神经元的新机制,为干预miR-24-3p/Pink1/线粒体自噬通路发展PD治疗新策略提供了直接的实验依据。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R742.5;R-332

【参考文献】