【摘要】：新生儿缺氧缺血脑病(hypoxia-ischemic encephalopathy,HIE)是围产期新生儿缺血缺氧引起的脑损伤疾病,是致使新生儿死亡和导致神经系统后遗症的重要原因之一,存活者多出现智力发育低下、运动发育迟缓、脑性瘫痪、癫痫等神经系统异常表现。因此,及时有效的治疗对于HIE患儿及其家庭意义重大。近年来,在治疗HIE方面,通过运用针刺、艾灸、穴位注射、小儿推拿、中药口服、熏蒸等中医疗法成效斐然,特别是针刺疗法,在治疗HIE后遗症方面,疗效极为显著。目的:以BNIP3介导的线粒体自噬保护通路作为切入点,建立缺血缺氧脑损伤(Hypoxia-ischemic brain damage,HIBD)大鼠模型,选择靳三针头部穴组(脑三针、颞三针、智三针)应用针刺干预,同时加入自噬激活剂雷帕霉素,通过免疫印迹等生物检测技术观察自噬相关蛋白NIX(Nip3-like protein X/adenovirus 19kDa interacting protein 3-like)、B 细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)的表达变化,旨在探讨针刺对缺氧缺血诱导的受损神经元中线粒体自噬水平的影响和作用机制,有利于为临床治疗新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxia ischaemic encephalopathy,HIE)提供新的思路和依据。方法:SPF级SD雌鼠20只,雄鼠10只,按1:1合拢配种,成功配种得孕鼠16只,剖宫产大鼠8只,代乳鼠8只,经异氟烷麻醉后剖宫产术,钳夹双侧子宫动脉10min,不超过30S,将无菌纱布盖于双侧子宫上,钳夹时间结束后,取出新生大鼠,立即、抢救,共得66只仔鼠,其余鼠淘汰。按随机数字表法,每组11只,分为模型组、针刺组、激活剂组、抑制剂组、针刺加激活剂组、针刺加抑制组。在HIBD模型大鼠出生第14天开始干预,每天干预一次,连续干预14天。通过免疫印迹等生物检测技术观察自噬相关蛋白NIX、Bcl-2的表达变化,结果:通过剖腹后钳夹双侧子宫动脉制造宫内窘迫子代鼠模型,HE染色结果:模型组大鼠脑部海马区神经细胞排列散乱,可见肿胀的神经元,结构疏松,神经元部分出现核固缩、深染及神经元细胞空泡化。针刺组大鼠海马区神经细胞排列整齐、结构正常,细胞核清晰,核仁明显。抑制剂组大鼠海马CA1区神经细胞结构被破坏更为严重,可见较多变性坏死的神经细胞,结构疏松,细胞间隙增宽,核固缩、深染,部分神经元胞核消失,空泡化。较抑制剂组,针刺加抑制剂组海马神经细胞形态破坏稍有改善,细胞结构较前紧密,间隙变窄,但神经元仍存在肿胀现象,细胞边界欠光滑。相反,激活剂组大鼠海马区神经细胞排列致密,神经细胞结构完整,细胞边界清晰光滑。针刺加激活剂大鼠海马区神经元细胞质密度增加,细胞排列整齐,层次清晰。WB结果模型组子代鼠海马组织中自噬相关蛋白Bcl-2的表达量明显高于正常组,提示造模24h内的自噬表达程度较高,可能与宫内窘迫模型(缺氧、缺血)激发自噬相关蛋白Bcl-2大量表达,从而促进自噬的发生有关。造模后,与模型组相比,针刺组NIX蛋白表达增加(P0.05),提示针刺可以适当促进自噬,从而促进脑细胞的修复。与模型组相比,抑制剂组NIX蛋白表达减少(P0.05),提示3-MA可有效抑制细胞线粒体自噬,在抑制剂的基础上加入针刺干预NIX蛋白表达较抑制剂组增加(P0.05),提示在外在条件抑制自噬情况下,“靳三针”头穴针刺干预仍可以有效促进细胞自噬。与模型组相比,激活剂组NIX蛋白表达增加(P0.05),提示雷帕霉素可有效促进细胞线粒体自噬,在激活剂的基础上加入针刺干预NIX蛋白表达较激活剂组增加(P0.05),提示针刺干预“靳三针”头穴可以配合激活剂共同促进细胞自噬。造模后,与模型组相比,针刺组Bcl-2蛋白表达量明显减少(P0.05),提示在给予针刺干预后,线粒体自噬情况有所增加。与模型组相比,抑制剂组Bcl-2蛋白表达显著增加(P0.05),提示3-MA可有效抑制细胞线粒体自噬,在抑制剂的基础上加入针刺干预Bcl-2蛋白表达较抑制剂组减少(P0.05),提示在外在条件抑制自噬情况下,“靳三针”头穴针刺干预仍可以有效促进细胞自噬。与模型组相比,激活剂组Bcl-2蛋白表达增加减少(P0.05),提示雷帕霉素可一定程度促进细胞线粒体自噬,在激活剂的基础上加入针刺干预Bcl-2蛋白表达较激活剂组减少(P0.05),提示“靳三针”头穴针刺干预可以配合激活剂共同促进细胞自噬,对因缺血缺氧而损伤的神经与脑细胞具有修复的积极作用。结论:1.针刺可以增强NIX表达及同时促进细胞自噬。2.针刺可影响自噬相关蛋白NIX、Bcl-2的表达,提示针刺促进受损神经元的修复可能与NIX、Bcl-2介导的线粒体自噬相关。3.针刺可适度促进受损区线粒体自噬的表达,同时减少受损区域神经元凋亡的发生,提示针刺可能通过促进线粒体自噬的适度表达,从而减少凋亡的发生。
【图文】：
相反，激活剂组大鼠海马区神经细胞排列致密，神经细胞结构完整，细胞边界清逡逑晰光滑。针刺加激活剂大鼠海马区yL经元细胞质密度增加，细胞排列整齐，层次清晰。逡逑（见图１）逡逑缺血缺氧脑损伤后，大鼠海马区神经细胞结构破坏严重，，表明ＨＩＢＤ可以加重患逡逑儿的神经功能缺损，这与临床表现和研究结果基本一致。经过针刺干｜后，神经元结逡逑构和形态明显得以改善。自噬被抑制时，与模型组相比，大鼠海马区＃经细胞损伤更逡逑为严重，细胞紊乱空泡化，核固缩、深染，间隙增宽，在此基础上进行针刺治疗，细逡逑胞形态虽有改善，但仍存在一定程度的神经损伤情况。这说明自噬在ＨＩＢＤ的修复过逡逑程中是与时效密切相关的，当缺血缺氧脑损伤后细胞凋亡向细胞次级坏死转化时，再逡逑加以治疗恐怕疗效不佳，势必存在不同程度的后遗症，早期针刺干预对ＨＩＢＤ患儿的逡逑预后疗效更好
逦针刺调控宫内窘迫ＨＩＢＤ大鼠ＮＩＸ表达改善缺血缺氧脑损伤的机制逦逡逑表１各组ＨＩＢＤ模型大鼠Ｂｃｌ－２蛋白表达比较ｄ±Ｓ）逡逑组别逦ｎ逦Ｂｃｌ－２逦＾逡逑模型组逦８逦１．０６±０．１９逡逑针刺组逦８逦１．７６±０．１４逡逑激活剂组逦８逦０．８８±０．１６４逡逑抑制剂组逦８逦１．２１±0．２９＃逡逑针刺＋激活剂组逦８逦０．６９±０．１４ａ逡逑针刺＋抑制剂组逦８逦０．８４±０．２６邋＊逡逑注：单因素方差分析，Ｆ＝６．９２，邋Ｐ＜０．０５。与模型组相比，１＜０．０５；与激活剂组相比，逡逑ＡＰ＜０．０５；与抑制剂组相比，＊Ｐ＜０．０５。逡逑ｍｏｄｅｌ邋ｙ＼ｃｕ邋ｐｙ＼ｐＡ邋３－ＭＡ邋Ａｃｕ＋ＲＡＰＡ邋／＼ＣＵ４－３邋ＭＡ邋２0逡逑
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R245;R-332
【参考文献】
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2668994
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