呼吸道合胞病毒的纳米免疫分析新方法研究

发布时间：2020-05-17 19:51

【摘要】：呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)属于副粘病毒科肺病毒属,是世界范围内引起婴幼儿下呼吸道感染的最常见病原体之一。在美国,据统计,每年有85000～144000的婴儿因病毒性肺炎或毛细支气管炎接受住院治疗。除此之外,某些老年人群和免疫功能缺陷的成年人群也是RSV感染的主要对象。根据世界卫生组织(WHO)的数据显示,全球每年的呼吸道合胞病毒感染者约有6400万例,而其中16万例因感染并发症死亡。经过几十年的努力,到目前为止依旧没有安全、有效的疫苗可用于RSV感染的预防。因此,建立简单、快速、灵敏的RSV实验室检测方法,对疾病的早期诊断、治疗以及预防控制都具有非常重要的意义。 呼吸道合胞病毒的检测方法主要基于三个方面：一是病毒的分离培养；二是病毒核酸的检测,三是病毒抗原或抗体的分析。虽然用组织培养分离病毒是目前诊断的最好方法或称为金标准,但是培养周期长,敏感性差,操作复杂,不适于大量检测。而病毒核酸检测方法灵敏度高、快速,并且能同时分析大批量样本,但却需要价格昂贵的精密仪器和专业的技术人员操作,不适于普通实验室或户外检测。免疫检测技术因其特异性强、方法简单等优势,在病毒抗原或抗体的检测中得到广泛的应用。不过,由于灵敏度低,很难用于临床RSV感染的早期诊断。为了解决上述问题,以实现RSV的高灵敏、简操作、低成本、可视化分析,本文将贵金属纳米颗粒及金/石墨烯纳米复合物引入免疫分析技术,建立了一系列高灵敏的RSV检测新方法。具体的研究工作如下： 1.金银纳米颗粒在RSV免疫分析中的应用 (1)利用酶反应产物作为信号分子的表面增强拉曼散射(SERS)免疫分析。银纳米颗粒(AgNPs)是常用的表面增强拉曼散射(SERS)活性基底。本文利用抗坏血酸及柠檬酸共还原氯化银溶胶法制得分散性好且SERS活性强的AgNPs,并将其用于RSV的免疫分析中。在该免疫学反应体系中,辣根过氧化物酶(HRP)在H2O2存在下催化底物TMB失去电子,得到氧化产物TMB+。溶液中成离子状态的TMB+与带负电AgNPs发生相互作用,化合物被吸附到AgNPs表面,产生强烈的SERS信号,实现对RSV的灵敏检测。相较于传统的ELISA显色法,灵敏度提高50倍。另外,由于酶催化TMB显色反应被广泛用于生化分析领域,因此利用酶反应产物的SERS分析策略具有普适性。 (2)金纳米粒子信号放大高灵敏度的检测RSV。金纳米粒子(AuNPs)因具有合成简单、比表面积大、负载效率高、性能稳定、生物相容性好等优点,被广泛应用于生化分析领域。本文利用AuNPs作为辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的载体,以HRP催化H2O2氧化TMB的吸光度值来检测RSV。由于AuNPs较大的比表而积可以增加酶标抗体在其表面的吸附量,所以同传统的ELISA相比,检测信号增强,最低检出浓度可以达到0.5pg/mL。另外该方法重复性好,选择性强,构建的免疫体系在3个星期内都能够稳定存在,具有很好的应用价值。 (3)结合金纳米层(GNPL)修饰的微孔板及酪胺信号放大(TSA)技术,建立双信号放大策略实现对RSV的高灵敏检测。在H2O2存在时,一些氧化酶(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)可以将底物酪胺催化后共价结合到周围蛋白的富电子表面形成酪胺化复合物,大量富集成以酶为中心的类似“树”状的聚集团,当对酪胺进行一定标记后,可以将原始信号几何级放大。本文以RSV为代表,首先采用化学镀金的方式在微孔板表面制备金纳米层,改善微孔对捕获抗体的吸附能力,提高检测灵敏度；再利用TSA技术使HRP大量沉积,催化底物TMB显色,进一步放大检测信号,实现RSV的高灵敏度分析。结果发现,方法在0.05～30pg/mL范围之间对RSV的响应具有良好的线性关系。另外,将RSV分别加入细胞培养液、胎牛血清和人血清,回收率在90.6%～98.1%,说明该方法可用于复杂样品中RSV的分析测定。 2.金/石墨烯复合纳米材料在RSV免疫分析中的应用 (1)利用Hg2+增强AuNPs/graphene模拟酶活性实现对RSV的色度免疫分析。据报道,纳米材料包括碳纳米材料、贵金属纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒等都具有类似过氧化物酶的催化活性,即在H2O2存在下,能够催化TMB等辣根过氧化物酶的底物发生氧化反应,产生颜色变化。但是当有生物分子比如蛋白质、DNA吸附后,催化活性被完全抑制,限制了这类纳米材料在分析化学中的应用。本研究通过鞣酸一步合成AuNPs/graphene复合物,发现该复合物具有模拟酶的性质,添加Hg2+可以显著增强其酶活性,即使是生物分子完全抑制其催化能力后。基于此,建立RSV的色度免疫分析新方法。实验结果表明,当RSV浓度在0.1～10pg/mL的浓度范围内时,吸收值与RSV浓度呈现良好的线性关系,最低检出浓度为0.04pg/mL。 (2)利用石墨烯和羟胺还原放大技术,建立超灵敏的等离子免疫分析方法用于病原体的检测。Graphene由于具有高的表面积,大量的金纳米粒子可以在其表面沉积；同时因为金纳米颗粒能高效催化HAuCl4-NH2OH氧化还原反应,使Au原子沉积到AuNPs表面,导致AuNPs的尺寸由小变大。基于此,建立一种超灵敏的RSV等离子免疫分析方法。首先,通过简单的水热法一步合成AuNPs/graphene纳米复合物,利用AuNPs和graphene均易吸附蛋白的优点,将抗体修饰于AuNPs/graphene杂合体表面,并加入由固相载体-RSV组成的微孔中形成三明治结构,此时加入HAuCl4-NH2OH溶液,微孔溶液的颜色发生变化,通过肉眼便可读出结果,特别适合于资源有限的地区。 总之,本论文以金银纳米颗粒或金/石墨烯复合纳米材料的优良性能建立了一系列RSV免疫分析新方法,不仅进一步拓宽了金银纳米材料在免疫分析中的应用,同时也为RSV感染的早期诊断以及治疗方案的合理选择都提供了新思路。
【图文】：

图1.1 RSV结构示意图Figure 1.1 Scheme of the RSV virion.RSV核酸为非节段性单股负链RNA,有包膜。从病毒结构来看，主要分为三层，内层为病毒核衣壳，由核蛋白N和RNA组成，除此之外，还应包括RNA依赖的RNA聚合酶，磷蛋白P和M2-1蛋白；中层为基质蛋白，，构成病毒的外壳骨

图1.2分子灯标修饰的AuNPs用于活细胞内mRNA的分析Figure 1.2 Hairpin DNA functionalized gold nanoparticles (hAuNPs) for detection ofmRNA in live cells.1.2.5纳米材料及其特性
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.14;O657.3

【参考文献】

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1 叶春洁;赵玉云;陈嵘;蒋兴宇;;金纳米粒子与蛋白质的相互作用及其应用[J];中国科学:化学;2012年12期

本文编号：2669090