熊果酸调节胰岛素和亮氨酸刺激mTOR信号的分子机制研究

发布时间：2020-05-18 06:32

【摘要】：第一部分熊果酸(Ursolic acid, UA)对胰岛素和亮氨酸刺激mTOR信号的影响 目的：(1)探讨UA对C2C12肌原细胞和分化成熟的C2C12肌管细胞中胰岛素刺激mTOR信号的影响；(2)探讨UA对分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中胰岛素刺激mTOR信号的影响；(3)探讨UA对C2C12肌原细胞和分化成熟的C2C12肌管细胞中亮氨酸刺激mTOR信号的影响；(4)探讨UA对分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中亮氨酸刺激mTOR信号的影响。 方法：(1)血清饥饿的C2C12肌原细胞和分化成熟的C2C12肌管细胞分别被给予不同浓度的UA干预60分钟,跟随10nM胰岛素共处理10分钟,Western Blot检测细胞内S6K和4E-BP1的磷酸化水平及蛋白质表达；(2)血清饥饿的分化成熟3T3-L1脂肪细胞分别被给予不同浓度的UA干预60分钟,跟随10nM胰岛素共处理10分钟,Western Blot检测细胞内S6K和4E-BP1的磷酸化水平及蛋白质表达；(3)血清饥饿的C2C12肌原细胞和分化成熟的C2C12肌管细胞分别被给予不同浓度的UA干预60分钟,跟随10mM亮氨酸共处理60分钟,Western Blot检测细胞内S6K和4E-BP1的磷酸化水平及蛋白质表达；(4)血清饥饿的分化成熟3T3-L1脂肪细胞分别被给予不同浓度的UA干预60分钟,跟随10mmM亮氨酸共处理60分钟,Western Blot检测细胞内S6K和4E-BP1的磷酸化水平及蛋白质表达。 结果：(1)与对照组相比,UA呈剂量依赖性抑制C2C12肌原细胞和分化成熟的C2C12肌管细胞中胰岛素对S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46磷酸化水平的诱导；(2)与对照组相比,UA呈剂量依赖性抑制分化成熟3T3-L1脂肪细胞中胰岛素对S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46磷酸化水平的诱导；(3)与对照组相比,UA呈剂量依赖性抑制C2C12细胞和分化成熟C2C12肌管细胞中亮氨酸对S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46磷酸化水平的诱导；(4)与对照组相比,UA呈剂量依赖性抑制分化成熟3T3-L1脂肪细胞中亮氨酸对S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46磷酸化水平的诱导。 结论：UA抑制C2C12细胞和3T3-L1脂肪细胞中胰岛素和亮氨酸对S6K和4E-BP1磷酸化水平的诱导。 第二部分PI3K/Akt途径在UA抑制胰岛素和亮氨酸刺激mTOR信号中的作用 目的：(1)探讨PI3K/Akt途径是否参与UA对胰岛素刺激mTOR信号的抑制；(2)探讨PI3K/Akt途径是否参与UA对亮氨酸刺激mTOR信号的抑制。 方法：(1)无血清培养C2C12细胞和3T3-L1脂肪细胞,分别给予不同浓度的UA预处理60分钟,跟随用或不用10nM胰岛素共处理10分钟,Western Blot检测细胞内Akt在Thr308和Ser473的磷酸化水平及蛋白质表达；(2)无血清培养C2C12肌原细胞,用或不用100nM Wortmannin预处理60分钟,跟随50μM UA共处理60分钟,然后用或不用10nM Insulin处理10分钟,Western Blot检测细胞内S6K在Thr389,4E-BP1在Thr37/46的磷酸化水平及Akt在Thr308的磷酸化水平和蛋白质表达；(3)无血清培养C2C12细胞和3T3-L1脂肪细胞,分别给予不同浓度的UA干预60分钟,跟随10mM亮氨酸共处理60分钟,Western Blot检测细胞内Akt在Thr308和Ser473的磷酸化水平及蛋白质表达；(4)无血清培养PDK1knockout(KO)/wildtype(WT) MEFs细胞,用或不用50μM UA预处理60分钟,跟随用或不用10mM亮氨酸共处理60分钟,Western Blot检测细胞内S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46的磷酸化水平及蛋白质表达。 结果：(1)UA处理明显抑制C2C12细胞和3T3-L1脂肪细胞中胰岛素对Akt在Thr308和Ser473磷酸化水平的诱导；(2)P13K抑制剂Wortmannin明显抑制C2C12肌原细胞中胰岛素对S6K在Thr389、4E-BP1在Thr37/46及Akt在Thr308的磷酸化水平的诱导,但UA对其S6K和4E-BP1磷酸化水平不具有进一步的抑制效应；(3)熊果酸和亮氨酸对C2C12细胞和3T3-L1脂肪细胞中Akt的磷酸化水平没有明显影响；(4)亮氨酸明显诱导PDK1KO/WTMEFs细胞中S6K在Thr389的磷酸化水平,UA处理明显抑制了亮氨酸对PDK1KO/WT MEFs细胞中S6K在Thr389磷酸化水平的诱导。 结论：UA主要通过抑制PI3K/Akt信号通路而抑制胰岛素对mTOR活性的诱导；UA抑制亮氨酸对mTOR活性的诱导不依赖于PI3K/Akt信号通路。 第三部分TSC1/2-Rheb信号通路和mTOR与Raptor/Deptor相互作用在UA抑制亮氨酸刺激mTOR激活中的作用 目的：(1)探讨UA是否通过TSC1/2依赖性抑制亮氨酸对mTOR活性的诱导；(2)探讨UA抑制亮氨酸诱导的mTOR激活是否依赖于Rheb;(3)探讨UA是否通过影响mTORC1蛋白质表达而抑制亮氨酸刺激的mTOR激活；(4)探讨UA是否通过影响mTOR与Raptor/Deptor相互作用而抑制亮氨酸对mTOR信号的激活作用。 方法：(1)无血清培养TSC1/2KO/WTMEFs细胞,给予50μMUA预处理60分钟,跟随用或不用10mM亮氨酸共处理60分钟,Western Blot检测S6K在Thr389和4E-BP1在Thr37/46的磷酸化水平及蛋白质表达；(2)无血清培养对照质粒、RhebWT和Rhebs16H过表达的C2C12细胞,给予50μM UA预处理60分钟,跟随10mM亮氨酸共处理60分钟,Western Blot检测S6K在Thr389的磷酸化水平及蛋白质表达；(3)无血清培养Deptor沉默的和对照的C2C12细胞,给予50μM UA预处理60分钟,跟随用或不用10mM亮氨酸共处理60分钟,Western Blot检测S6K在Thr389的磷酸化水平；(4)无血清培养C2C12细胞,给予50μM UA预处理60分钟,跟随用或不用10mM亮氨酸共处理60分钟,使用抗mTOR抗体免疫沉淀mTOR,通过Western Blot检测细胞内mTOR,Raptor, Deptor和Tubulin水平以及免疫沉淀物中mTOR, Raptor和Deptor的水平。 结果：(1)TSC1/2敲除明显增加S6K在Thr389磷酸化水平,亮氨酸处理进一步增加TSCl/2敲除的MEFs细胞中S6K磷酸化水平,UA明显抑制TSCl/2敲除的MEFs细胞中亮氨酸对S6K磷酸化的诱导；(2)C2C12细胞中RhebWT和Rhebs16H过表达明显增加S6K在Thr389的磷酸化水平,亮氨酸进一步促进这些细胞中S6K磷酸化水平,尽管UA没有抑制RhebWT和Rhebs16H过表达引起的S6K磷酸化增加,但是它抑制了亮氨酸对S6K磷酸化的诱导；(3) Deptor敲减明显增加S6K在Thr389的磷酸化水平,但亮氨酸处理进一步增加Deptor敲减的C2C12细胞中S6K磷酸化水平,UA明显抑制亮氨酸对Deptor敲减的C2C12细胞中S6K磷酸化水平的诱导；(4)UA没有影响C2C12细胞中mTOR, Raptor和Deptor等蛋白质的表达,UA没有干扰mTOR与Raptor/Deptor之间的相互作用。 结论：UA抑制亮氨酸刺激的mTOR激活不依赖TSC1/2-Rheb通路；UA不通过影响mTORC1蛋白质表达和mTOR与Raptor/Deptor之间相互作用而抑制亮氨酸对mTOR信号的诱导。 第四部分RagB在UA抑制亮氨酸刺激mTOR激活中的作用 目的：(1)探讨RagB是否介导UA对亮氨酸刺激mTOR信号的抑制；(2)探讨UA是否影响RagB与Raptor之间的相互作用；(3)探讨UA是否抑制mTOR在溶酶体中的定位。 方法：(1)无血清培养对照质粒、RagBWT和RagBQ99L过表达的C2C12细胞,分别给予50μM UA预处理60分钟,跟随10mM亮氨酸共处理60分钟,Western Blot检测S6K在Thr389的蛋白质表达和磷酸化水平；(2)无血清培养RagB沉默的和对照的C2C12细胞,给予501μM UA预处理60分钟,跟随10mmM亮氨酸共处理60分钟,Western Blot检测S6K在Thr389的磷酸化水平和蛋白质表达；(3)无血清培养RagB过表达的C2C12细胞,给予50μM UA预处理60分钟,跟随用或不用10mM亮氨酸共处理60分钟,细胞通过交联剂DSP处理,免疫沉淀Raptor,使用Western Blot检测免疫沉淀物中Raptor和RagB的水平；(4)无血清培养RagB过表达的C2C12细胞,给予50μM UA预处理60分钟,跟随10mM亮氨酸共处理60分钟,细胞通过交联剂DSP处理,免疫沉淀Flag-RagB, Western Blot检测免疫沉淀物中Flag-RagB和Raptor的表达；(5)无血清培养C2C12细胞,给予50μM UA预处理60分钟,跟随10mM亮氨酸共处理60分钟,细胞用抗mTOR和抗LAMP1抗体孵育,共聚焦免疫荧光显微镜观察mTOR在溶酶体中的定位。 结果：(1) RagBWT过表达对S6K磷酸化水平没有明显影响,但增强了亮氨酸对S6K在Thr389磷酸化的诱导,UA明显抑制了亮氨酸对mTORCl活性的诱导；RagBQ99L明显促进基础水平的S6K磷酸化,但亮氨酸处理没有进一步增强S6K磷酸化水平,UA明显抑制RagBQ99L过表达细胞中S6K磷酸化水平；(2)UA对RagB沉默的C2C12细胞中亮氨酸刺激的mTOR信号没有明显影响；(3)免疫共沉淀实验显示亮氨酸明显促进RagB与Raptor之间的相互作用,UA明显抑制这种相互作用；(4)共聚焦免疫荧光实验显示亮氨酸增加mTOR与溶酶体标志物LAMP1的共定位,UA的处理抑制了mTOR与LAMP1的共定位。 结论：RagB介导UA对亮氨酸诱导mTOR信号的抑制；UA通过干扰RagB与Raptor之间的相互作用并阻止mTOR在溶酶体中的定位而抑制亮氨酸刺激mTOR的激活。
【图文】：

文 第第二章结果量依赖性抑制C2C12细胞中胰岛素对S6K和4E-BP1蛋白磷导饿的C2C12肌原细胞和肌管细胞分别被给予不同浓度的UA用或不用lOnM的胰岛素共处理10分钟，Western Blot检测蛋白S6K在Thr389及4E-BP1在Thr37,46的a愃峄�水平及它们果显示，UA呈剂量依赖性抑制细胞内S6K和4E-BP1的磷酸化度抑制效果最明显（图1-1至1-4)。

饥饿的C2C12肌原细胞和肌管细胞分别被给予不同浓度的UA干预60随用或不用lOnM的胰岛素共处理10分钟，Western Blot检测细胞内游蛋白S6K在Thr389及4E-BP1在Thr37,46的a愃峄�水平及它们的蛋白结果显示，UA呈剂量依赖性抑制细胞内S6K和4E-BP1的磷酸化水平，浓度抑制效果最明显（图1-1至1-4)。IIIIIIHHII —-- P-S6K Thr389mm mm m 9m _|s6kmm 4 ? P-4E-BP1 Thr 遍管着，，

本文编号：2669310