低强度脉冲超声促进SD大鼠骨髓间充质干细胞迁移归巢及机制研究

发布时间：2020-05-21 05:36

【摘要】：目的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种成体多能干细胞,体外易获得,分裂增殖快,可以向多个方向分化,是目前干细胞治疗领域研究和使用较多的一类干细胞。在干细胞治疗研究中,BMSCs通过血液循环迁移聚集到受损组织的过程称为归巢,这个过程是干细胞治疗的关键部分,直接关系到干细胞在损伤组织处聚集的数量和修复的效果。目前归巢的BMSCs来源可分为体内自有和体外给予。内源性的BMSCs数量极少,归巢率较低;外源性注射的BMSCs在损伤组织处归巢率也低,因此如何提高BMSCs的归巢能力是干细胞治疗领域亟待解决的难点。低强度脉冲超声(Low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)可以增强体外培养的BMSCs的增殖能力和多向分化能力,并且在促进骨折愈合的研究过程发现其也可以增强体内BMSCs的动员和补充,从而加速骨折愈合,但迄今为止未见更深入的研究报导。本课题旨在通过体内外实验来研究LIPUS对BMSCs的迁移及归巢能力的影响,并且通过基因表达谱芯片检测LIPUS对BMSCs归巢相关基因的调节,深入探讨其机制,以期为LIPUS应用于干细胞治疗提供更为坚实的理论依据,促进LIPUS在干细胞治疗领域的广泛应用。方法1.筛选能促进BMSCs迁移的适宜超声强度。根据LIPUS辐照声强不同将BMSCs分为四组:对照组、30mW/cm~2组、60mW/cm~2组和90mW/cm~2组。超声组细胞按照各组声强辐照20min,对照组细胞进行假辐照。通过细胞划痕、transwell小室模型检测各组细胞的体外迁移能力,FITC-鬼笔环肽染色检测F-肌动蛋白(F-actin)的变化。2.动物实验验证LIPUS促进BMSCs迁移归巢。随机选择30只雌性SD大鼠(对照组和LIPUS组各15只),进行单侧后肢股骨骨缺损造模。对BMSCs采用绿色荧光标记并经LIPUS预处理(30mW/cm~2,20min/d,2d)后于大鼠尾静脉注射。X片观察缺损位点的愈合过程(2周)。两周后处死大鼠,HE染色观察新生骨区,荧光显微镜观察靶区BMSCs的绿色荧光表达。3.深入探讨机制。对LIPUS预处理(30mW/cm~2,20min/d,2d)的BMSCs进行基因表达谱测序,统计对照组和超声组差异表达的基因,并且对差异表达的基因进行GO富集,选取表达量上调的4个与细胞迁移相关的基因(Itga8,Ccl5,Tm7sf2,Tuba3b)进行实时荧光定量PCR验证。采用测温装置对LIPUS辐照过程中温度的变化进行检测。结果1.划痕后0h、24h及48h对各组细胞的划痕面积进行测量,超声组的面积小于对照组(P0.05),30mW/cm~2组的24h划痕面积(0.47±0.21mm~2)和48h的划痕面积(0.19±0.10mm~2)与其他组比均为最小(P0.05)。Transwell迁移实验中,较之于对照组,超声组穿过transwell上室的BMSCs数量更多,30mW/cm~2组最多(213.0±34.76个),是对照组的2.39倍(P0.05)。F-actin染色实验中,超声组的细胞骨架变狭长,纵轴方向可见更多的应力丝,数量及荧光强度也明显增加,超声组中30mW/cm~2组的荧光强度最高(125.43±17.43,P0.05)。2.造模后即刻X片检测可见对照组及LIPUS组大鼠的右侧后肢股骨,均存在大小一致的圆形缺损,提示骨缺损造模成功。造模2周后,X片观察到LIPUS组股骨的缺损已经愈合,对照组缺损未完全闭合。HE染色可见LIPUS组骨髓区成骨细胞较多。荧光显微镜下LIPUS组骨缺损部位绿色荧光强度更高(12.06±0.23),而对照组荧光强度较低(38.2±0.29),二者比较有显著性差异(P0.05)。3.基因表达谱测序共筛选出差异基因237条,LIPUS组上调表达39条,下调表达198条。分子功能富集显示33个基因和G-蛋白偶联受体(P0.001)活性相关,生物过程富集显示42个基因与G-蛋白偶联受体信号相关(P0.001);分子组成富集显示LIPUS组BMSCs有71个基因与细胞膜的整体组成相关。对与细胞迁移相关的上调基因Itga8,Ccl5,Tm7sf2,Tuba3b进行实时荧光定量PCR检测,结果与基因表达谱测序结果一致,提示本研究中基因表达谱测序所得的基因表达数据是有效可靠的。LIPUS辐照过程中对照组和LIPUS组的测温结果没有统计学差异(P0.05)。结论LIPUS可以促进BMSCs体外迁移能力,声强为30mW/cm~2时促进效应最为明显。LIPUS预处理可以作为一种提高外源性BMSCs体内归巢率的手段,其机制可能是LIPUS的机械效应对BMSCs细胞膜表面的的G-蛋白偶联受体产生了作用,从而使得BMSCs在体内外的迁移和归巢能力提高。
【图文】：

小室,声强,对照组,细胞

将超声组和对照组的细胞加入24孔8μm的transwell小室上室中，24h后对迁移过小室的细胞进行固定、染色，，倒置相差显微镜下拍照（图1-3），对各组穿过小室的细胞数目进行对比（图1-4），各超声组穿过小室的细胞数量均多于对照组（89.53±19.27个），且差异均具有统计学意义（P<0.05）。超声组中，LIPUS强度为30mW/cm2时穿过小室的细胞数量最多（213.0±34.76个，P<0.05），说明LIPUS具有刺激BMSCs迁移穿过transwell小室的能力，30mW/cm2的LIPUS促进细胞迁移的能力最强。

相对荧光强度,对照组,细胞骨架,微丝

出LIPUS辐照后，BMSCs的微丝变的粗长，数量增多，细胞骨架感受了来自LIPUS的声学信号，使得F-actin的表达发生了改变。用Image J软件进一步测量各组荧光值（图1-6），结果显示超声组的相对荧光强度均高于对照组（51.94±12.76，P<0.05），各超声组之间，30mW/cm2组的相对荧光强度（125.43±17.43）高于其他两组（P<0.05）。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

【参考文献】