ePet-EYFP小鼠脑干下行五羟色胺神经元电生理学、形态学及神经递质调控性研究

发布时间：2017-03-25 23:14

  本文关键词：ePet-EYFP小鼠脑干下行五羟色胺神经元电生理学、形态学及神经递质调控性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脑干中的5-HT神经元对行进运动的产生起着至关重要的作用,但由于技术的限制过去没有办法系统研究此类神经元。ePet-EYFP小鼠模型的出现使得此类研究成为可能,因此本文将使用该模型开展对5-HT神经元的研究；过去没有对5-HT神经元进行细胞膜特性与神经元形态的综合性研究,而此类研究对揭示5-HT神经元对行进运动产生的机制至关重要,为此开展了本课题的研究；行进运动的产生需要神经递质(NMDA、5-HT、ACh等等)的参与调控,但此类递质(NMDA和ACh)对小鼠脑干5-HT神经元的调控机制尚不清楚,因此本文进一步研究了NMDA和ACh对脑干下行5-HT神经元膜特性的影响,进而探讨行进运动神经调控产生的可能机制。1研究目的：利用ePet-EYFP新生小鼠(出生后1-11天),本文研究了脑干中缝核群(Midline Raphe Nuclei, MRN)和锥体旁侧区域(Parapyramidal Region, PPR) 5-HT神经元的电生理学和形态学特征,另鉴于NMDA和ACh两种神经递质在行进运动中起着重要的诱发和调节作用,本文研究了NMDA和ACh对脑干下行5-HT神经元膜特性的影响,探讨行进运动神经调控产生的可能机制。2研究方法：本研究使用健康转基因ePet-EYFP小鼠39只。制备脑干切片,利用荧光显微镜寻找5-HT神经元,进行膜片钳全细胞记录(Whole Cell Patch Clamp Recording),记录神经元的静息膜电位、动作电位、细胞膜时间常数等,分析神经元的输入电阻,动作电位的阈值、幅度、宽度等；研究这些参数(静息膜电位、输入电阻和电压阈值等)在加入神经递质(NMDA和ACh)前后的变化特征。全细胞记录的同时,通过电极内加入的蓝色荧光染料(Cascade Blue,10%)对神经元进行细胞染色标记,观察5-HT神经元的形态。3试验结果：(1)通过PCR检测,对ePet-cre和R26-stop-EYFP小鼠进行繁殖筛选,通过四代筛选获得ePet-EYFP纯合子转基因小鼠模型。(2)本研究使用出生后1-11天的转基因ePet-EYFP小鼠,共记录脑干5-HT神经元67个(中缝核群34个,锥体旁侧区域33个),非5-HT神经元20个。根据神经元对去极化脉冲电流的放电反应,5-HT神经元可以分为三种类型：单峰型(11/67)、瞬变型(11/67)和持续型(45/67)。(3)在脑干5-HT神经元中测到多种电生理特性,主要包括：超极化激活内向电流(Hyperpolarization-activated inward current, Ih,5/67),抑制后反弹(Post-inhibitory rebound, PIR,3/67),持续性内向电流(Persistent Inward Current, PIC,31/67),兴奋性突触后电位(Excitatory Post-synaptic Potential, EPSP,14/67),抑制性突触后电位(Inhibitory Post-synaptic Potential, IPSP,1/67)。(4)MRN和PPR中5-HT神经元膜特性无显著性差异(P0.05)。膜电位分别为-60.5±5.0mV和-62.7±7.4 mV。与非5-HT神经元相比,5-HT神经元的输入电阻和膜时间常数更大(P0.05),输入电阻分别为944.0+315.9 MΩ和1402.8±944.1 MΩ；膜时间常数分别为32.7±11.8 ms和58.9+25.6 ms。(5)三种类型的动作电位中,持续型的电流阈值(16.9±15.6 pA)比单峰型(31.7±20.3pA)更低(P0.05)。持续型的电压阈值(-36.5±6.6mV)和输入电阻(1279.7±827.2 MΩ)比瞬变型(-29.9±5.9 mV,2124.7±1176.2 MΩ)更低(P0.05)。瞬变型电压阈值(-29.9±5.9mV)最高,单峰型(-31.6±6.7 mV)居中,持续型(-36.5±6.6 mV)最低。三种动作电位类型的动作电位高度、宽度、后极化深度和宽度没有显著性差异(P0.05)(6)加入10-20μM的NMDA以及NMDA+ACh混合溶液,NMDA减小5-HT神经元(n=12)的输入电阻和动作电位后超极化深度(P0.05),而电压阈值和动作电位高度没有显著性变化(P0.05)。NMDA+ACh混合液减小5-HT神经元(n=12)的输入电阻和动作电位后超极化深度、降低动作电位高度(P0.05),同时使5-HT神经元的电压阂值去极化(P0.05)。(7)本研究染色标记5-HT神经元29个。按照突起数量(除去3个无突起神经元)分为假单极(n=4)、双极(n=9)和多极神经元(n=13)；按照胞体形态分为三角形(n=7)和椭圆形(n=22),不同形态的5-HT神经元的胞体直径和表面积无显著性差异(P0.05)。双极5-HT神经元和多极5-HT神经元各电生理指标之间无显著性差别(P0.05),假单极5-HT神经元的膜时间常数小于多极5-HT神经元(P0.05)。三角形和椭圆形5-HT神经元各电生理指标之间并没有显著性差异(P0.05)4结论：(1)脑干5-HT神经元和非5-HT神经元兴奋性无显著性不同,说明5-HT神经元的兴奋性可能不是诱发行进运动的主要因素,而5-HT神经元的下行脊髓投射特性和脊髓调节机制有可能是主要的因素；(2)脑干5-HT神经元的形态特征可能不是5-HT神经元诱发行进运动产生的主要机制,但形态上的差别可能为5-HT神经元提供接受其他神经系统(如中脑运动区)不同调节的基础；(3) NMDA和ACh对脑干下行5-HT神经元膜特性的调控可能是产生行进运动神经调控的可能机制之一。
【关键词】：脑干 下行5-HT神经元 电生理学 形态学 神经递质
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R338
【目录】：

• 论文摘要6-9
• ABSTRACT9-14
• 第一部分、文献综述14-23
• 1 5-HT神经元14-18
• 1.1 5-HT的产生和代谢14-15
• 1.2 5-HT神经元的分布15-18
• 2 5-HT神经元在肢体运动中的作用18-20
• 2.1 中枢模式发生器18-19
• 2.2 5-HT神经元与肢体运动19-20
• 3 神经元膜特性概述20-23
• 3.1 神经元膜特性20-21
• 3.1.1 被动电学特征20
• 3.1.2 主动膜特性20-21
• 3.2 5-HT神经元膜特性21-22
• 3.3 5-HT神经元形态特征22-23
• 第二部分、试验部分23-55
• 1. 材料和方法23-36
• 1.1 试验材料23-25
• 1.1.1 实验动物23-24
• 1.1.2 主要试剂24-25
• 1.1.3 主要仪器25
• 1.2 实验方法25-36
• 1.2.1基因型鉴定25-28
• 1.2.1.1 小鼠DNA提取25-26
• 1.2.1.2 标准PCR扩增26-27
• 1.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳27-28
• 1.2.2 膜片钳试验仪器和设备28-29
• 1.2.3 主要溶液的配制29-30
• 1.2.4 记录玻璃微电极的制备30-31
• 1.2.5 脑干切片的制备31
• 1.2.6 脑干切片的全细胞膜片钳记录31-32
• 1.2.7 药剂灌流系统32-33
• 1.2.8 5-HT神经元电生理学测试33-35
• 1.2.9 5-HT神经元形态学测试35-36
• 1.2.10 信号采集和统计方法36
• 2 实验结果与分析36-50
• 2.1 5-HT神经元在脑干的分布36-38
• 2.2 5-HT神经元电生理学特性38-42
• 2.2.1 持续内向电流(PIC)40
• 2.2.2 超极化激活电流(I_h)和超极化激活电流反弹(Rebound)40-41
• 2.2.3 兴奋性突触后电位(EPSP)41-42
• 2.2.4 抑制性突触后电位(IPSP)42
• 2.3 三种类型的5-HT神经元42-45
• 2.4 NMDA和ACh对5-HT神经元膜特性的综合调控作用45-46
• 2.5 不同形态5-HT神经元膜特性46-50
• 3 讨论50-55
• 3.1 5-HT神经元电生理特点50-53
• 3.1.1 5-HT神经元电生理指标50-51
• 3.1.2 脑干PPR和MRN 5-HT神经元膜特性51
• 3.1.3 三种动作电位类型的5-HT神经元51-52
• 3.1.4 NMDA和ACh对5-HT神经元膜特性的综合调控作用52-53
• 3.2 5-HT神经元形态特征53
• 3.3 空间钳问题53-55
• 第三部分、研究总结55-57
• 1 主要结果与结论55-56
• 2 主要创新之处56
• 3 主要缺陷与不足56
• 4 研究展望56-57
• 附录1 试剂盒说明书57-60
• 附录2 缩略词60-61
• 参考文献61-68
• 后记68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 刘少雄;许鹿希;;大鼠脑干5-羟色胺神经元的分布——免疫细胞化学研究和定量分析[J];神经解剖学杂志;1987年02期

  本文关键词：ePet-EYFP小鼠脑干下行五羟色胺神经元电生理学、形态学及神经递质调控性研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：267930