结核分枝杆菌感染相关的糖复合物诊断分子标志物的筛选与鉴定
发布时间：2020-05-27 13:26
【摘要】：结核分枝杆菌是引起结核病的病原体。其导致的较高的发病率和致死率,目前仍是很多发展中国家需要面临的一个重大的亟待解决的健康问题。2012年据世界卫生组织(WHO)统计,全球约有130万人死于结核病。我国活动性肺结核人数高居世界第二位,是结核病高负担国家。近年来,伴随着多重耐药结核杆菌(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)的出现,以及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染与TB联合发病,结核病的疫情在发展中国家一直呈上升的趋势,非结核分枝杆菌病也呈逐渐增加趋势。早期以及明确的诊断对治疗、预后有着极其重要的意义。目前临床上应用的结核病诊断技术主要有结核菌素(PPD)试验、痰细菌培养、抗酸染色、PCR、血清学抗体检测、IFN-y的T-Spot检测及基因芯片等方法,而这些诊断方法在临床应用中均存在或多或少的局限性,如PPD试验的假阳性率高,无法区分是感染还是卡介苗-BCG接种；而T-Spot及基因芯片操作繁琐成本较局；ELISpot或T-Spot不能检测T细胞免疫缺陷的感染者；抗体的检测无法诊断感染早期抗原出现然而抗体还未产生的“窗口期”；PCR无法区分结核杆菌的活动状态,并且需要成本高的试剂和仪器,不能区分感染样品中的活菌和死菌；痰培养的方法周期长、易污染；抗酸染色的方法灵敏度低,检出率低。因此,亟待开发新型的、有效的结核诊断试剂,特别是早期抗原诊断和肺外结核诊断试剂的开发具有重要意义。 我们选定中国主要流行株结核分枝杆菌北京基因型菌株作为筛选毒性结核分支杆菌特异性分子标记物的实验模型,以甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖作为搜寻的主要诊断分子标记。结核分枝杆菌北京基因型菌株是亚洲广泛流行的结核致病菌,是1995年人们利用Spoligotyping技术对中国北京地区的结核分枝杆菌进行基因分型,发现了具有显著相似遗传特征的结核分枝杆菌菌株群。结核分枝杆菌北京基因型菌株其较H37Rv菌株有更强的毒力、更广泛的传播性以及耐药性。尤其是在中国,结核分枝杆菌北京基因型菌株在流行菌株中占绝对优势,因而适于作为本研究的实验模型。甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖(Mannosylated lipoarabinomannan, ManLAM)是普遍存在于毒性分枝杆菌表面的一种较为丰富的脂糖。像许多毒性结核分支杆菌一样,北京基因型菌株表面也存在着ManLAM脂糖。ManLAM其在不同的结核分枝杆菌中结构各异,并且在结核分枝杆菌感染宿主细胞的过程中主要发挥免疫抑制作用。ManLAM脂糖随着菌体侵入宿主细胞在细胞内部分裂增殖以及与宿主细胞相互作用的过程中脱落并释放入感染部位并进入血循环。由于ManLAM在不同的毒性结核分枝杆菌的结构差异,以及其在感染过程中可脱落进入血循环,因而极适于作为诊断分子标记。因此本研究针对北京基因型菌株特异的ManLAM脂糖,筛选出能与之特异性结合的具有抗体特性的适配子(aptamer),从而实现通过对临床结核病体液标本中ManLAM脂糖的检测达到结核脂糖抗原早期诊断目的。 鉴于ManLAM脂糖的免疫原性较弱,其抗体的制备较为困难,因此本研究利用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)筛选获得了针对北京基因型结核分枝杆菌表面脂糖ManLAM的单链DNA适配子“抗体”T9,其对北京基因型菌株ManLAM脂糖具有高亲和力(Kd=685±131nM)和高特异性。通过对收集得到的临床活动性结核病人痰液标本及血清标本进行检测,适配子T9可以有效诊断结核病,同时采用适配子T9在对病人痰液的检测与金胺O染色法检测阳性标本的结果相关性较高(r2=0.8062),对活动结核病人血清的检测其诊断特异性和灵敏度分别为77.45%和92.65%,显示出了较高的诊断水平；同时采用适配子T9对肺外结核血标本进行检测,也能够有效地诊断肺外结核病,其诊断特异性和灵敏性分别为94.12%和90.32%,从而为临床诊断提供新策略。研究过程中,我们意外发现,6名确诊结核病的婴幼儿和儿童(6个月-8岁)患者在T-Spot检查中显示为阴性,而在本研究的ELONA (T9)检测结果显示,其全部为阳性。因此推测,通过对临床血标本中ManLAM脂糖抗原的检测,能够较T-Spot法提高对婴幼儿和儿童的感染结核分枝杆菌的检出率。 鉴于蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,参与各种生命活动过程,如细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤迁徙、免疫保护等。而不同种类的凝集素具有特异性的结合不同的糖苷的特性,因此为探讨结核分枝杆菌感染对宿主的糖蛋白糖苷的影响,本次研究利用这一特性建立的高通量的凝集素芯片技术,从而对结核分枝杆菌感染引起宿主的糖蛋白和糖苷的改变进行了检测。采用凝集素芯片开展以下两方面工作： (1)对结核分枝杆菌标准株H37Rv毒性菌株和H37Ra弱毒分枝杆菌分别感染小鼠腹腔巨噬细胞后细胞膜糖蛋白和糖苷的差异表达进行检测,筛选出差异较大的凝集素ABA,其特异性结合的糖蛋白在H37Rv感染的小鼠腹腔巨噬细胞表面感染前后显著增高,而在H37Ra感染的小鼠腹腔巨噬细胞表面感染前后无明显变化；。进一步在体外验证了凝集素ABA能够明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬H37Rv,说明结核感染后的细胞表面凝集素ABA特异结合的糖蛋白增高,ABA可以阻断细菌的感染；进一步在结核病人中验证,发现凝集素ABA与结核患者PBMC细胞膜表面结合力也远高于健康人的。通过质谱技术对凝集素ABA结合的巨噬细胞膜糖蛋白鉴定,在检测的蛋白中筛选出CD44和Glectin-9作为候选差异分子。(2)使用凝集素芯片技术检测活动性结核病人与健康人血清中差异表达的糖蛋白和糖苷,结果显示凝集素EBL、MAL-I、ABA结合的糖苷较健康人的显著上升,并且通过免疫印迹(Western Blot)验证发现了差异表达的蛋白条带。随后,对凝集素ABA鉴定的结核病患者血清中差异表达的糖蛋白,取分子量介于10kD-15kD区域进行质谱鉴定,并在诸多种类的蛋白质中筛选出血小板4因子作为候选差异分子可能可以作为诊断分子标志物之一。 综上所述,首先我们运用SELEX筛选技术成功地筛选获得了高亲和力、高特异性结合北京基因型结核分枝杆菌表面脂糖ManLAM的ssDNA适配子T9,并建立ELONA检测方法对结核病血清以及痰液进行检测,该研究成果为结核特异脂糖抗原的早期诊断提供了新的策略；我们还采用凝集素芯片技术对结核分枝杆菌感染导致宿主糖蛋白和糖苷的差异表达进行了筛选,筛选出的差异表达的糖蛋白和糖苷,包括凝集素ABA特异结合的巨噬细胞和PBMC表面的糖蛋白如CD44和Glectin-9、和结核患者血清中的糖蛋白如血小板4因子,这些糖蛋白和其糖苷将可能为结核病特异诊疗提供新的诊断标志物。
【图文】：
银染结果显示初糖中主要存在两种成分，，其主要成分ManLAM脂糖分子量约集中在34kD至26kD之间，LAM分子量约集中在26 kD至17kD之间（图1A);随后的糖原染色鉴定，其主要成为仍为两种多糖类物质，其分子量分布与确酸银染色分布一致（图IB);经过纯化之后的ManLAM脂糖经x核嵋旧笤
本文编号：2683596
【图文】：
银染结果显示初糖中主要存在两种成分，，其主要成分ManLAM脂糖分子量约集中在34kD至26kD之间，LAM分子量约集中在26 kD至17kD之间（图1A);随后的糖原染色鉴定，其主要成为仍为两种多糖类物质，其分子量分布与确酸银染色分布一致（图IB);经过纯化之后的ManLAM脂糖经x核嵋旧笤
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