非同步化正常人外周血淋巴细胞细胞周期限制点的研究

发布时间：2020-05-28 17:35

【摘要】：目的： 评价传统的无血清饥饿法同步化对数生长期人外周血淋巴细胞以及Molt-4细胞的效果。 方法： 将在体外培养处于对数生长期的人外周血淋巴细胞和Molt-4细胞转到无血清的培养基中继续培养24、48h。收集细胞,流式细胞术检测不同时间点细胞的凋亡(Annexin-V/PI)、增殖(Ki67)和Cyclin E的表达水平。 结果： 随着体外饥饿时间的延长(24、48h),对数生长期的人外周血淋巴细胞凋亡率由(32.27±2.90)%增加到(61.82±2.47)%；ki67阳性率由(67.20±8.54)%减少到(51.87±0.59)%;G1期CyclinE+细胞的比例由饥饿前的(63.35±4.99)%分别减少至(46.04±1.84)%和(44.46%±2.97)%；S期细胞比例由饥饿前的(12.43±1.42)%分别增加到(16.73±0.96)%和(20.70±1.86)%；G2/M期细胞的比例由饥饿前的(1.49±0.98)%分别增加到(5.18±1.00)%和(8.06±1.38)%。 将对数生长期的Molt-4细胞转入无血清培养基中培养24、48h后也得到了类似的结果。 结论： 按照传统的无血清饥饿法操作,将对数生长期的人外周血淋巴细胞以及对数生长期的Molt-4细胞转移到无血清培养基中饥饿24、48h,尽管凋亡率增加,增殖率下降,但是饥饿48h的时候处于S期的细胞比例依旧高达20%,并未同步化至静止期。所以传统的无血清饥饿法并不能使对数生长期的细胞完全同步化。 目的： 在非同步化的正常人淋巴细胞中探索细胞周期限制点(Restriction Point, R-point)存在的真实性,为其存在于G1期而非GO期提供证据。 方法： 新鲜分离的人外周血淋巴细胞在含有1%PHA的完全培养基中培养12、18、24h后一部分转入低血清(1%FBS)培养基中继续培养至满48h。收集细胞,流式细胞术检测CyclinE表达,分析G1-cyclinE-、Gl-cyclinE+、S和G2/M各期阳性细胞比例；另一部分转入无血清培养基中继续培养至满48h,流式细胞术通过检测CyclinE表达,分析G1-cyclinE-、Gl-cyclinE+、S和G2/M各期阳性细胞比例、G0/G1期中P21表达,同时检测细胞的增殖(Ki67)以及DNA掺入(BrdU)水平。 结果： 1、新鲜分离的人外周血淋巴细胞在含有1%PHA的完全培养基中培养0、12、18、24、48h后,S期比例增加,静止期的细胞逐渐进入细胞周期。 2、新鲜分离的人外周血淋巴细胞在含有1%PHA的完全培养基中培养12、18、24h后分别转入低血清(1%FBS)培养基中继续培养至满48h,此过程中S期细胞比例在13%到24%不等,不能实现同步化细胞的缓慢释放进入细胞周期。 3、新鲜分离的人外周血淋巴细胞在含有1%PHA的完全培养基中培养12h后转入无血清培养基中继续培养至满48h,尽管G1期细胞有75%左右表达CyclinE,但并未有细胞进入S期；18h后转入无血清培养基中,S期、G2/M分别有19%、2%左右细胞表达CyclinE;24h后转入无血清培养基中,S期、G2/M中CyclinE的表达率则分别有23%和3.7%左右。 4、新鲜分离的人外周血淋巴细胞在含有1%PHA的完全培养基中培养12h后转入无血清培养基中继续培养至满48h,细胞Ki67阳性表达率仅有(7.83±1.36)%,18h和24h则分别增加到(21.89±2.72)%和(39.98±7.51)%。 5、新鲜分离的人外周血淋巴细胞在含有1%PHA的完全培养基中培养12h后转入无血清培养基中继续培养至满48h, BrdU掺入率仅有(2.18±1.37)%,而18h和24hBrdU掺入率则分别增加到(5.23±0.53)%和(12.06±3.49)%。 6、新鲜分离的人外周血淋巴细胞在含有1%PHA的完全培养基中培养12h后转入无血清培养基中继续培养至满48h,G0/G1期细胞P21阳性表达率为(82.45±4.61)%,而18h和24h则分别降到(49.89±19.11)%和(41.09±15.55)%。 结论： 1、新鲜分离的人外周血淋巴细胞在含有1%PHA的完全培养基中培养后会逐渐进入细胞周期,作为细胞周期限制点的研究对象更加科学合理。 2、新鲜分离的人外周血淋巴细胞在含有1%PHA的完全培养基中培养后转入低血清(1%FBS)培养基中继续培养,此过程中S期细胞始终保持较高比例,不能实现同步化细胞的缓慢释放进入细胞周期,所以转入低血清(1%FBS)培养基中无法完成细胞周期限制点的研究。 3、本研究首次证实,在非同步化的正常人外周血淋巴细胞中确实也存在细胞周期限制点,且存在于G1期而非GO期。对于经过1%PHA刺激的人外周血淋巴细胞来说,其细胞周期限制点的定位可表现在1%PHA刺激生长12h到18h之间。
【图文】：

新鲜分离的人外周血淋巴细胞调亡率为5.44%左右，细胞活力较好，此状态可以满足后续实验的要求。如图1-1。寸 PBL-0h-a.001■?—：，“ S ■.： ：.?人■ ■ I ?-Vcvi . - ? *N ： — 二T" ： .於：。三； ■ ■ ■■:■■■ 110 10 10 10FL1-HQuad °/o Qated % TotalUL O.OO O.OOUR 0.91 0.47"LL 94.56 48.81LR 4.53 2.34图1-1新鲜分离的人外周血淋巴细胞调亡检测结果2、无血清饥饿法同步化对数生长期人外周血淋巴细胞24、48h后调亡(Annexin V/PI)检测结果(1)对数生长期人外周血淋巴细胞在无血清培养基中培养24小时后调亡率为(32.27±2.90) %，与对照组（7.35±0.30) %相比，差异有统计学意义（PO.OOl，/=14.82)。如图 1-2-1。(2)对数生长期人外周血淋巴细胞在无血清培养基中培养48小时后调亡率为(61.82±2.47)%，与对照组（8.60±1.27)相比，差异有统计学意义(P<0.001，/=33.18)。如图1-2-2。(3)对数生长期人外周血淋巴细胞培养24、48小时后调亡率结果统计图

-3对数生长期人外周血淋巴细胞培养24、48h后洞亡检测结果统计图
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2

【共引文献】

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本文编号：2685588