自噬在小鼠骨髓间充质干细胞衰老损伤中作用机制的探究

发布时间：2020-05-29 12:38

【摘要】：目的通过分离培养年轻和老年小鼠的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs),对细胞的形态、表型、细胞凋亡及自噬水平进行比较,探究自噬在骨髓间充质干细胞衰老过程中发挥的作用,并进一步对相关信号通路蛋白进行研究,并且对相关的分子调节通路进行深入分析。方法选取健康的清洁级年轻C57小鼠(8周龄)和老年C57小鼠(18个月龄),在无菌环境中分离股骨、胫骨,体外分离BM-MSCs,并培养至第3代,通过光学显微镜观察两组细胞形态。采取流式细胞术检测对两组BM-MSCs细胞表型进行测定,进一步运用TUNEL染色标记两组BM-MSCs凋亡的状况。使用ELISA试剂盒对两组BM-MSCs细胞旁分泌因子VEGF、bFGF、IGF-1、HGF的表达水平的检测。Western Blotting检测自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5、p62及信号通路相关蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR的表达。结果在显微镜下观察年轻组及老年组BM-MSCs,细胞均呈典型的纤维样梭形生长。两组BM-MSCs表型表达鉴定呈CD90、CD29阳性,CD31、CD45阴性,提示两组BM-MSCs表型表达无明显差异;与年轻组BM-MSCs比较,老年组BM-MSCs的TUNEL阳性细胞数增多,提示凋亡情况上升(P0.05);同时老年组BM-MSCs旁分泌因子VEGF、bFGF、IGF-1、HGF的表达水平下降(P0.05),提示衰老BM-MSCs旁分泌功能明显降低;进一步Western Blotting检测老年组BM-MSCs自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5表达水平下降,而p62蛋白表达水平呈增加趋势(P0.05),提示在衰老BM-MSCs自噬的程度下降;与年轻组BM-MSCs相比,老年组BM-MSCs信号通路相关蛋白p-Akt、p-mTOR表达增多(P0.05)。结论老年组BM-MSCs细胞形态及表型与年轻组BM-MSCs无明显差别。老年组BM-MSCs细胞凋亡增多,旁分泌功能减弱,自噬水平下降,同时Akt/mTOR通路磷酸化水平上升,提示衰老可能通过活化Akt/mTOR通路参与自噬调节,导致自噬活性下降,进一步影响细胞衰老的发展进程。
【图文】：

略显稀疏(图 1A)。流式细胞术检测 BM-MSCs 细胞表BM-MSCs 表面标志物 CD31、CD45 呈阴性，CD90 和 CD29 呈流式细胞术检测老年组 BM-MSCs 这四种细胞表型，结果显示Cs 细胞表面标志物 CD31、CD45 表达呈阴性，CD90、CD29 两组 BM-MSCs 细胞表型表达无明显差异(图 1 B)。

来测定两组BM-MSCs的细胞凋亡情况(图2A)。免疫荧光镜下观察细胞，，DAPI 染色显示两组 BM-MSCs 的细胞总数无明显差别，TUNEL 染色显示老年组 BM-MSCs 中凋亡细胞较年轻组明显增多，统计显示年轻组 BM-MSCs 凋亡率为 12.58±1.21%，老年组 BM-MSCs 凋亡率为37.83±3.43%(图 2B)，两组数据经过 t 检验分析，提示老年组 BM-MSCs 细胞凋亡高于年轻组 BM-MSCs 细胞凋亡(P<0.05)。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R363

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本文编号：2686939