不同培养体系下诱导iPSCs定向分化为运动神经元的研究

发布时间：2020-05-31 04:55

【摘要】：背景及目的人诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是一类具有自我更新能力、体外无限增殖和多向分化潜能特点的细胞,目前在医学研究中应用广泛。iPSCs分化为的各种体细胞可用于建立体外疾病模型,在运动神经元疾病的研究中,如何批量培养iPSCs并诱导其分化为高纯度的运动神经元为首先需要解决的问题。iPSCs的培养体系根据有无饲养层可分为有饲养层和无饲养层两种体系,有饲养层培养体系为传统的干细胞培养体系,目前研究的神经分化方案多于该体系中进行,但有饲养层细胞在维持干细胞状态的同时也存在异源性污染的风险;而无饲养层培养体系为近些年为了干细胞应用于临床而逐渐兴起的培养体系,其可以避免异源性细胞的污染,但长期在此种体系下培养的iPSCs的特性需进一步探究。本实验旨在有无饲养层两种体系中培养iPSCs,并结合先前有饲养层体系中的运动神经元诱导方案,在无饲养层培养体系中,尝试诱导iPSCs定向分化为运动神经元,并比较两种体系中的分化效率,为后期优化分化方案提供依据。材料与方法1、实验分组:根据培养体系不同将实验分为2组:(1)有饲养层培养体系:小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)在本体系中作为饲养层细胞支持iPSCs生长;(2)无饲养层培养体系:Matrigel作为介质促进iPSCs贴壁并支持细胞生长,mTeSR1作为无饲养层培养基。2、iPSCs的培养:将iPSCs分别接种于MEF饲养层细胞及Matrigel上,连续培养5代后,光镜下观察细胞形态,细胞免疫荧光鉴定多能性标记物SOX2,OCT4的表达。3、iPSCs向运动神经元的分化:通过不同的小分子化合物组合诱导iPSCs分化28天获得成熟的运动神经元(motor neuron,MN),光镜下观察细胞形态,细胞免疫荧光鉴定分化各阶段细胞:神经上皮细胞(neuroepithelial progenitors,NEP),运动神经元前体细胞(motor neuron precursor cells,MNP),运动神经元细胞,并对NEP及MNP细胞进行细胞计数;qRT-PCR检测NEP及MNP相关基因的转录水平,并进行比较。结果1、在两种培养体系中,iPSCs表现出不同的细胞克隆形态,通过传代培养均可维持其典型的细胞形态,并高表达多能性标记物SOX2,OCT4。2、两种培养体系下,iPSCs定向分化的NEP、MNP、MN均各自表达其特异性标记物。3、有饲养层体系中NEP细胞SOX1,HOXA3及MNP细胞OLIG2,OCT4基因表达明显高于无饲养层(P0.01),PAX6及SOX2表达无统计学差异(P0.05)。结论:1、在MEF作为饲养层及无饲养层两种培养体系下,iPSCs可长期增殖并维持其多能性。2、无饲养层培养体系中的iPSCs可以有效的分化为运动神经元,但其分化效率低于有饲养层培养体系。3、有饲养层细胞可能分泌了某些无饲养层体系中缺乏的因子促进了神经分化,对这些因子进行排查,可进一步优化无饲养层培养体系。
【图文】：

培养的,核质比,核质,细胞克隆

Cs 光镜下细胞形态层体系中，iPSCs 呈克隆状生长，克隆为卵圆形，克隆边，可多层堆积，细胞核较大，核仁清晰，有较高的核质iPSCs 扁平贴壁生长，形成不规则的细胞克隆，克隆内细核质比（图 1.1）。

多能性,免疫荧光染色,标记物

图 1.2 iPSCs 多能性标记物免疫荧光染色论Cs 的多能性及无限增殖特性的维持需外来因子的干预F 细胞分泌的生长因子，细胞因子和细胞外基质如 TG-511 和玻连蛋白 6 等均可维持干细胞的特性[31,32]，同细胞分化的催化剂，随着细胞增殖，MEF 细胞可以度生长及融合，从而预防细胞分化。然而，MEF 作，其弊端也不应忽视：①增加了工作量；②可能会胞；③它可能产生干细胞和成纤维细胞的混合培养临床的应用。异种细胞是支原体污染的常见来源，必需的营养物质，支原体污染可能影响细胞生理学表型，核型和细胞因子表达的诱导。这些感染往往影响实验结果。为了预防异种污染，有研究者提出培养 iPSCs，但使用人源饲养细胞时，病毒和非病毒
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

【参考文献】