日本血吸虫钙连蛋白基因的生长发育与免疫保护功能的初步研究
发布时间：2020-05-31 08:37
【摘要】：目的:钙连蛋白(Calnexin,Canx)是内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白和重要的内凝集素分子伴侣,监控真核细胞蛋白折叠和装配,调节内质网Ca2+稳态和Ca2+介导的信号转导过程,参与多种重要生物学功能。本课题组前期研究发现,日本血吸虫(Schistosomaa jaaponicum,Sj)Canx(SjCanx)基因在不同宿主因子影响下的肺期童虫中具有显著的差异表达。本文初步研究该基因对日本血吸虫童虫生长发育的影响;同时克隆、表达其蛋白后,观察重组蛋白的免疫保护作用,为探寻新的疫苗与药物作用靶点提供基础资料。方法:利用在线工具对SjCanx氨基酸序列进行生物信息学分析,使用ClustalX2软件对血吸虫Canx及其它物种Canx氨基酸序列进行比对,利用Swiss Model在线工具绘制SjCanx三维模式图,使用Mega 5.5 sofeware构建SjCanx和其它物种同源物系统进化树。收集日本血吸虫不同发育期的虫体,提取RNA并逆转录为cDNA,用Real-Time PCR法鉴定SjCanx基因在日本血吸虫不同发育时期虫体中的mRNA表达。设计并合成SjCanx基因的小干扰RNA(siRNA),在日本血吸虫尾蚴经机械断尾转化成童虫后将其与童虫共培养,收集培养6 d的日本血吸虫童虫,一部分置于光镜下观察、拍照,并使用IPP6.0软件对童虫进行形态学统计分析;另一部分利用real-timePCR检测目的基因的沉默效果。提取日本血吸虫成虫的总RNA,逆转录获得cDNA,根据SjCanx对应的胞外段基因序列设计并合成特异性引物,以cDNA为模板扩增,目的基因与pET28a(+)质粒进行双酶切、连接和转化,挑取阳性克隆,PCR法检测后测序鉴定;提取测序正确的质粒DNA,将其转化入原核表达宿主菌BL21;挑取阳性克隆,用IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE、western blot检测表达结果,免疫磁珠法纯化重组蛋白(rSjCanx)。用纯化获得的rSjCanx免疫新西兰家兔,获取多克隆抗血清,免疫组织化学法定位目的基因在童虫中的分布。将rSjCanx免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫2周后感染日本血吸虫尾蚴30±1条,42天后解剖小鼠,灌注法冲虫收集日本血吸虫成虫,摘取0.5 g左叶肝脏组织匀浆、消化后收集虫卵,显微镜下计数,计算减虫率和减卵率;取黄豆大小右叶肝脏组织固定、HE染色,测量单个虫卵形成的肉芽肿面积,计算面积减小率(与对照组比较);同时眼底静脉采血,收集血清,ELISA夹心法测定Th1型和Th2型细胞因子IL-4和IFN-γ的含量。结果:生物信息学分析显示,SjCanx的分子式为C2949H4528N782O907S18,为稳定性亲水跨膜蛋白,与SmCanx的同源性较高,相似率达84%。Real-time PCR法检测SjCanx基因在不同发育时期虫体中的表达,结果发现其mRNA在感染3 d的肺期童虫中表达水平最高、虫卵中最低。siRNA作用后,培养6 d的干扰组童虫其体长、体宽、面积及体积分别为145.79±26.08μm、53.25±9.56μm、(2.88±0.67)×104μm2、(20.88±7.42)×104μm3,均显著小于对照组的 159.36±35.74 μm、56.33±9.45μm、(3.30±0.73)×104μm2、(25.62±9.27)×104μm3(P0.05);Real-time PCR结果显示,SjCanx基因的沉默效率为55.4%(P0.05)。根据SjCanx胞外段对应基因序列,设计的上游引物为CGGGATCCAATCCTGAGTTAGAAC CTGAAG、下游引物为 CCGCTCGAGTTTCTCATTGTAAGTTTCCCG,构建了重组表达质粒pET28a(+)-SjCanx,获得的rSjCanx经western-blotting检测发现其大小与理论分子量一致,约为53.5 kDa。rSjCanx免疫家兔,获取的抗血清经ELISA法测定其滴度达1:12800。免疫组化结果显示,SjCanx基因主要定位于童虫的实质和表膜。免疫保护结果发现,rSjCanx免疫组诱导的减虫率10.36%(P0.05)、减卵率为30%(P0.05),单个虫卵导致的肝肉芽肿面积为(0.157 ±0.036)×105 um2,比佐剂组的肉芽肿面积减小23%(P0.05)。ELISA法检测各组血清的细胞因子结果显示,IFN-y和IL-4在空白对照组、佐剂组与rSjCanx免疫组分别为 19.75±5.38 pg/ml 和 7.56±1.92 pg/ml、22.05±5.05 pg/ml 和 7.600±2.53 pg/ml,37.33±8.07 pg/ml和7.65±2.18 pg/ml;统计学分析发现,免疫组小鼠血清IFN-y显著高于佐剂组(P0.05),但IL-4无显著差异(P0.05)。结论:SjCanx基因沉默后影响了童虫的生长发育,提示SjCanx在童虫生长发育过程中具有重要作用;克隆表达了SjCanx胞外段对应基因的rSjCanx;rSjCanx可产生30%的减卵率,其机制可能是通过增强Th1型细胞因子IFN-y免疫应答来实现。
【图文】：
３．实验结果逡逑３．１邋ＳｙＣａｎｘ基因的生物信息学分析逡逑■ＳｙＣａｎｘ基因的生物信息学分析结果见图３．１。如图３．１所示，汾Ｃａｎｘ属于逡逑Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ超家族。没Ｃａｎｘ基因的开放阅读框长度为１７４９邋ｂｐ，编码一个５８２个逡逑氨基酸残基的蛋白，相对分子量为６６ｋＤｓ，编码产物见表３．１，预测等电点为逡逑ｐＨ５．０６，＞５／Ｃａｎｘ的氨基酸组成和含量分析见表３．２。由表３．２可知，，汾Ｃａｎｘ由Ｃ、逡逑Ｈ、Ｎ、０、Ｓ五种原子组成，共有９１８４个原子，分子式为Ｃ２９４９Ｈ４５２８Ｎ７８２0９0７ＳＩ８；逡逑估计半衰期．？在哺乳动物网织红细胞体外为３０小时；在酵母体内大于２０小时；逡逑在大肠杆菌细胞体内为大于１０小时。由该蛋白不稳定系数为３５．７０，可知为稳定逡逑蛋白。利用Ｅｘｐａｓｙｐｒｏｔｓｃａｌｅ分析蛋白疏水性结果见图３．２。如图３．２所不，该蛋逡逑白为亲水蛋白。ＳｉｇｎａｌＰ４．１预测分显示，l挘茫幔睿行藕烹
本文编号：2689590
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３．实验结果逡逑３．１邋ＳｙＣａｎｘ基因的生物信息学分析逡逑■ＳｙＣａｎｘ基因的生物信息学分析结果见图３．１。如图３．１所示，汾Ｃａｎｘ属于逡逑Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ超家族。没Ｃａｎｘ基因的开放阅读框长度为１７４９邋ｂｐ，编码一个５８２个逡逑氨基酸残基的蛋白，相对分子量为６６ｋＤｓ，编码产物见表３．１，预测等电点为逡逑ｐＨ５．０６，＞５／Ｃａｎｘ的氨基酸组成和含量分析见表３．２。由表３．２可知，，汾Ｃａｎｘ由Ｃ、逡逑Ｈ、Ｎ、０、Ｓ五种原子组成，共有９１８４个原子，分子式为Ｃ２９４９Ｈ４５２８Ｎ７８２0９0７ＳＩ８；逡逑估计半衰期．？在哺乳动物网织红细胞体外为３０小时；在酵母体内大于２０小时；逡逑在大肠杆菌细胞体内为大于１０小时。由该蛋白不稳定系数为３５．７０，可知为稳定逡逑蛋白。利用Ｅｘｐａｓｙｐｒｏｔｓｃａｌｅ分析蛋白疏水性结果见图３．２。如图３．２所不，该蛋逡逑白为亲水蛋白。ＳｉｇｎａｌＰ４．１预测分显示，l挘茫幔睿行藕烹
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