抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶0TUD3转基因小鼠模型的建立及表型分析

发布时间：2017-03-26 17:06

  本文关键词：抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶0TUD3转基因小鼠模型的建立及表型分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：PTEN是1997年新发现的定位在第10号染色体上的抑癌基因,经过18年的研究发现它是在肿瘤的发生与发展中具有重要的抑癌作用。PTEN在脑胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中具有很高的突变率或低表达率,并且在Cowden综合症、Bannayan-Zonana综合症等肿瘤易感性疾病中也有很高的遗传性突变。此外,PTEN基因杂合缺失的小鼠能自发形成乳腺癌、甲状腺瘤、子宫内膜瘤等多种肿瘤,并且PTEN基因纯合缺失的小鼠也因细胞增殖过快而细胞程序性死亡不足在胚胎期9.5天出现死亡。最近对PTEN转基因小鼠的研究还发现,PTEN在小鼠体内过表达后,小鼠对肿瘤抵抗能力增强。这些证据都表明:PTEN是一个重要的抑癌基因。PTEN在细胞内既定位在细胞质,也定位在细胞核。细胞质内的PTEN可以利用其脂质磷酸酯酶活性,逆转PI3K的磷酸化作用,抑制PI3K-Akt与m TOR信号通路,发挥抑癌功能;而在细胞核内,PTEN主要通过维持基因组稳定性发挥抑癌功能。目前的研究发现PTEN对肿瘤发生的抑制作用与以往理解的“单倍剂量不足”理论不同,其蛋白水平的微量变化即与肿瘤的发生密切相关。当PTEN蛋白水平减少至80%时,乳腺癌的发生率就高达40%,足以说明PTEN剂量变化对肿瘤易感性存在重要影响。虽然PTEN从转录到翻译表达的过程中受到磷酸化、乙酰化、泛素化、类泛素化等多种修饰,但在细胞内,蛋白质的稳定依然主要由泛素化修饰调节。泛素化修饰在生物体内是一个平衡的调节系统,泛素化修饰与去泛素化修饰共同作用调控蛋白质的稳定性。目前发现的PTEN的泛素连接酶已有5个(NEDD4-1、WWP2、XIAP、CHIP、TRIM27/RFP),但直到我们开展筛选能调控PTEN蛋白稳定性的去泛素化酶这个工作时,能调控PTEN蛋白稳定性的去泛素化酶依然未被揭示。我们通过对人类去泛素化酶库中的接近90个去泛素化酶筛选后,发现并验证了OTU家族的去泛素化酶OTUD3(OTU Domain Containing 3)是一个能够去除PTEN泛素化,调节其蛋白稳定性的去泛素化酶。并且,细胞学实验也表明OTUD3可以通过稳定PTEN的蛋白水平抑制PI3K-Akt通路,抑制细胞增殖、迁移和成瘤能力。既然OTUD3在分子与细胞实验中能够利用其去泛素化酶活性,稳定PTEN蛋白水平并发挥抑癌功能,那是否在生理条件下OTUD3也具有同样的功能呢?围绕着“在生理条件下OTUD3是否能稳定PTEN并发挥抑癌功能”这一科学问题,我们利用基因工程技术,采用能够保护插入片段完整高效表达的人工细菌染色体(BAC)策略,构建了OTUD3与PTEN转基因小鼠模型,并对表型进行分析研究。通过分离培养小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞,对OTUD3与PTEN转基因小鼠单独建系并开展了一系列实验。结果发现:在OTUD3转基因小鼠中,OTUD3与PTEN存在相互作用,PTEN蛋白水平显著高于野生型小鼠,并且这一作用是通过去除PTEN的泛素化,稳定其蛋白水平实现的。此外,我们利用MEF细胞开展实验发现OTUD3在小鼠原代细胞中能够通过稳定PTEN蛋白水平参与抑制PI3K-Akt信号通路。在动物的整体表型上,我们对这两个小鼠模型的梯度表达系小鼠进行观察后发现:OTUD3转基因小鼠与PTEN转基因小鼠在体型上均小于野生型小鼠,并随着OTUD3与PTEN表型量的增加而逐渐明显。说明OTUD3在体内过表达后,能使PTEN蛋白水平上升并发挥其在代谢上在体过表达后调控小鼠体型大小的功能。MMTV-Py V MT转基因小鼠可以自发形成乳腺癌,是用于乳腺癌研究的经典小鼠模型。为了在体内研究OTUD3的抑癌功能,我们将OTUD3转基因小鼠与MMTV-Py V MT转基因小鼠交配构建转基因小鼠双杂模型,跟踪观察OTUD3在乳腺癌发生发展中的作用。研究发现OTUD3在体内过表达后,不论是在肿瘤形成的时间上,还是数量与大小上,都对乳腺癌的发生与发展具有显著的抑制作用。从遗传学上充分证明OTUD3是PTEN的一个重要的稳定调控因子,在体内OTUD3发挥着重要的抑癌功能。本文还探究了在不同的乳腺癌细胞系中OTUD3与PTEN蛋白水平的关系。通过对比发现在有PTEN表达的乳腺癌细胞系中,OTUD3的表达量与PTEN蛋白水平基本上是一致的,说明OTUD3对PTEN的调控作用是普遍存在的,而不是仅仅是在某些特定的乳腺癌细胞系中。此外,OTUD3在高转移能力的乳腺癌细胞系中异常低表达,提示OTUD3在乳腺癌中可能参与肿瘤的转移或耐药过程。本文通过免疫组织化学实验探讨了OTUD3、USP13与PTEN在乳腺癌组织中蛋白水平的关系。结果显示OTUD3与USP13在乳腺癌组织中对PTEN的蛋白稳定性调控上具有协同作用,当二者在肿瘤组织中蛋白水平都低时,PTEN的蛋白水平最低,反之亦然;而当一高一低时,PTEN蛋白处于中等水平。我们的研究通过利用OTUD3转基因小鼠模型的MEF细胞证明了OTUD3在生理条件下可以通过去除PTEN的泛素化,稳定PTEN的蛋白水平;而对OTUD3与PTEN转基因小鼠整体表型的研究也表明:OTUD3通过稳定PTEN蛋白水平,在转基因小鼠整体上显现出了与OTUD3相似的表型。同时,通过引入MMTV-Py V MT乳腺癌自发小鼠模型构建双杂小鼠模型,验证了OTUD3可以通过调控PTEN的蛋白水平发挥抑癌功能。综合这三点,我们的研究为回答“OTUD3是否是PTEN真正的生理去泛素化酶?”这一科学问题提供了重要的遗传学依据。此外,在乳腺癌细胞系中对OTUD3与PTEN蛋白水平关系的研究以及OTUD3、USP13、PTEN三者在乳腺癌组织中调控关系的研究也拓宽了我们对OTUD3作为抑癌基因发挥抑癌功能的认识。
【关键词】：PTEN 去泛素化酶 OTUD3转基因小鼠 抑癌 乳腺癌
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.5;R-332
【目录】：

• 缩略词6-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 第一章 前言14-28
• 1．肿瘤危害现状14
• 2. 抑癌蛋白PTEN的结构与功能14-17
• 3. PTEN的蛋白稳定性调控17-23
• 3.1 转录与翻译后调控17-19
• 3.2 泛素化修饰19-20
• 3.3 去泛素化修饰20-23
• 4. 转基因动物的制备与应用23-28
• 第二章 PTEN去泛素化酶OTUD3 转基因小鼠模型的建立28-40
• 1. 研究背景28-31
• 2. 材料与方法31-35
• 2.1 打靶载体31
• 2.2 抗体31
• 2.3 引物31
• 2.4 试剂31-32
• 2.5 细胞培养相关溶液32
• 2.6 转基因小鼠的构建、繁殖与鉴定32
• 2.7 MEF细胞实验方法32-34
• 2.8 小鼠组织蛋白提取34
• 2.9 Western blotting步骤34
• 2.10 统计方法34-35
• 3．结果35-38
• 3.1 OTUD3 转基因小鼠的制备及繁殖鉴定35
• 3.2 OTUD3 转基因小鼠体内OTUD3 蛋白过表达并稳定PTEN蛋白水平35-38
• 4. 小结38
• 5. 讨论38-40
• 第三章 OTUD3 调节小鼠体型大小40-48
• 1. 研究背景40-41
• 2. 材料与方法41
• 2.1 动物41
• 2.2 引物41
• 2.3 试剂与方法41
• 2.4 统计学分析41
• 3．结果41-46
• 3.1 PTEN转基因小鼠的制备及鉴定繁殖41-44
• 3.2 OTUD3 转基因小鼠体型小于野生型小鼠44-46
• 4. 小结46
• 5. 讨论46-48
• 第四章OTUD3 转基因小鼠抑制乳腺癌的发生发展48-54
• 1. 研究背景48-49
• 2. 材料与方法49-50
• 2.1 动物49
• 2.2 引物49
• 2.3 试剂49
• 2.4 鼠尾基因组精提步骤49-50
• 2.5 乳腺整体染色50
• 3．结果50-53
• 3.1 OTUD3tg/-/PyVtg/-双杂小鼠的获得50-51
• 3.2 OTUD3tg/-/PyVtg/-小鼠抑制乳腺癌的发生与发展51-53
• 4. 小结53
• 5. 讨论53-54
• 第五章OTUD3 在乳腺癌细胞系中的表达研究54-61
• 1. 研究背景54
• 2. 材料方法54-55
• 2.1 细胞54-55
• 2.2 乳腺癌组织芯片55
• 2.3 抗体55
• 2.4 细胞培养相关溶液及培养方法55
• 2.5 免疫组化55
• 2.6 数据分析55
• 3. 结果55-59
• OTUD3 在高转移的乳腺癌细胞系中低表达55-57
• 3.2 OTUD3 与USP13 协同调控PTEN的蛋白稳定性并在乳腺癌组织中低表达57-59
• 4. 小结59
• 5. 讨论59-61
• 总结与展望61-66
• 参考文献66-73
• 附录73-85
• 附录 1：实验仪器、设备73-74
• 附录 2：实验相关试剂配方74-75
• 附录 3：综述75-85
• 参考文献82-85
• 个人简历以及硕士期间发表论文、所获奖励85-86
• 致谢86

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