脊髓背角iNOS过表达在带状疱疹后遗神经痛大鼠模型中的表达及意义

发布时间：2017-03-27 20:05

  本文关键词：脊髓背角iNOS过表达在带状疱疹后遗神经痛大鼠模型中的表达及意义，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景及目的疼痛是人类对疾病最难以忍受和最痛苦的体验之一,尤其像带状疱疹后遗神经痛(PHN),主要表现为受损皮区痛觉过敏和异常疼痛,病程较长,迁延不愈,持续约3个月以上。其患病群体主要以老年人为主,而我国正在步入老龄化社会,带状疱疹后遗神经痛将严重威胁着老年人的健康。在临床上,应用抗病毒药物、抗抑郁药物、针灸以及中医中药进行治疗效果均不如意,目前还没一种行之有效的方法对其进行预防和治疗。PHN属于一种特殊的神经病理性痛,其发病机理目前并未搞清楚。经典观点认为,带状疱疹后遗神经痛(PHN)可能是由外周神经和末梢的炎症和变性引起的,近年来越来越多的观点认为其与中枢神经系统也有莫大的联系[1]。脊髓背角是痛觉传导通路的第二级神经元所在部位,是痛觉调控的关键部位。本实验就是以脊髓背角为切入点,从脊髓水平来探索和研究PHN的病理机制。在预实验中,我们发现在大鼠痛觉过敏和异常疼痛形成的时间段,脊髓背角诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的活性和蛋白表达水平也相应地显著升高。那么,我们推测:①iNOS可能与PHN存在密切联系;②它在PHN痛觉过敏和异常疼痛的形成过程中发挥着重要作用;③应用iNOS的抑制剂或清除剂后,应该能达到镇痛效果;④它对临床用药具有重要的指导意义。为了验证这些推测,我们设计了本试验。方法⑴建立带状疱疹后遗神经痛大鼠模型:将大鼠随机分为三组,分别为vzv接种组,假接种组和阴性对照组(n=10/组)。将水痘-带状疱疹病毒(vzv)感染cv-1细胞,再用磷酸盐缓冲液收集大约有80%被感染的cv-1细胞制成接种溶液。制成的接种溶液接种于sd大鼠双侧后足趾皮下,作为vzv病毒接种组。接种不含vzv病毒的接种液的大鼠作为假接种组(mock组),接种生理盐水的作为对照组(naive组)。vzv组随后形成痛觉过敏和异常疼痛,且经抗病毒药物治疗,观察其痛觉阈值是否发生改变。⑵形态学检测:10%水合氯醛麻醉大鼠,经4%多聚甲醛灌注成功,仔细取大鼠脊髓腰4-6节段,然后分别用20%蔗糖、30%蔗糖脱水,4℃过夜。包埋固定,恒冷机切片机进行切片。用兔抗inosigg,兔抗nnosigg或兔抗enosigg进行免疫组化染色。再用免疫荧光双标染色。显微镜或激光共聚焦显微镜下观察脊髓背角变化,与对照组比较。获取数据,统计学分析。⑶westernblot检测:麻醉大鼠,在冰上快速取出大鼠脊髓背角组织,裂解并提取总蛋白,进行蛋白定量,电泳,转膜,分别以抗inos,nnos或enos的一抗4℃孵育过夜。加入二抗,发光,分析蛋白表达的相对量参数,并与内参β-actin比较,以矫正蛋白定量、上样过程中存在的实验误差,比较各组蛋白样品之间的表达差异。获取数据,统计学分析。⑷鞘内置管给药:对vzv组大鼠进行鞘内置管术。置管成功后,当大鼠机械痛觉阈值降至最低时,我们经鞘内应用ptio(no清除剂,30μg),l-name(nos广谱抑制剂,50μg),l-nil(inos抑制剂,100μg),7-nina(nnos抑制剂,45μg)或l-nio(enos抑制剂,25μg)[2],对照组给予对应量的生理盐水,观察镇痛效果。于给药后0、10、20、30、40、50、60分钟检测其痛觉阈值变化,记录数值,统计分析。结果⑴vzv组在接种病毒溶液后第5天,机械痛觉阈值开始下降(11.4±1.6g),约两周阈值降到最低点(5.8±1.4g),持续至第8周逐渐恢复,12周左右接近正常(25.4±3.6.6g)。与假接种组和阴性对照组相比较,(p0.05)。受损皮区也没有皮疹,与临床phn患者临床表现相似。建成phn模型后,进行系统抗病毒药物治疗,phn大鼠机械痛觉阈值在给药前后未发生明显变化,这与临床上对phn患者进行抗病毒效果一致。⑵大鼠形成痛觉过敏和异常疼痛相应的时间段,对切片进行染色发现,与对照组相比,inos在vzv组大鼠脊髓背角的染色密度明显增加,并且其免疫阳性结构也主要聚集在脊髓背角的i和ii层。再进行免疫荧光双标染色可以看出,脊髓背角inos免疫阳性结构有且仅表现在胶质原纤维酸性蛋白gfap标记的免疫阳性细胞(可能为胶质细胞)。而ox42或neun标记的免疫阳性细胞并无inos免疫阳性结构。⑶westernblot检测显示,vzv组大鼠在病毒接种后第五天左右,脊髓背角inos的蛋白表达水平出现了明显增加(0.21±0.08)。在接种后两周inos的蛋白表达升到颠峰(0.68±0.13),这种状态将维持着,相应情况下naive组(0.06±0.02)和mock组(0.05±0.01)(n=10/组;p0.05)。由此可见,vzv组大鼠痛觉阈值的变化与inos的活性表达呈负相关(p0.001,r= 0.89)[1]。与对照组相比,vzv组脊髓背角nnos或enos的蛋白表达水平在痛觉过敏或异常疼痛形成前后几乎无变化。⑷phn大鼠模型痛觉过敏和异常疼痛最明显的时刻,经鞘内给予ptio(no清除剂,30μg),l-name(nos广谱抑制剂,50μg),l-nil(inos抑制剂,100μg),均能达到镇痛效果。而鞘内给予其它抑制剂对于痛觉阈值并没发生改变。(n=10/组)结论:⑴phn不是简单地由疱疹病毒的急性复制所形成的。带状疱疹后遗神经痛是一种特殊的神经病理性痛,属于慢性痛,虽然由水痘带状疱疹病毒感染引起,但是它的发病机制不是简单地由病毒的急性复制所形成。在实验中,大鼠皮肤未起皮疹,给予抗病毒治疗不能使疼痛缓解也验证了这一点。⑵nos对疼痛的调控主要集中在脊髓背角的i和ii层。位于痛觉传导通路的第二级神经元所在处的正是脊髓背角,其最外层为i层或着称为边缘层。i层中大多数神经元属于特异性疼痛神经元,接受来自皮肤和内脏痛觉信号的aδ纤维;紧靠边缘层为ii层或胶状质,接受c纤维传入。nos就是在这完成对疼痛的调控。⑶nos的表达变化和痛觉阈值的高低呈显著的负相关。inos的启动子结合位点能与nf-κb结合,激活nos,nos的活性升高,产生过量的no,间接地激活c-fos(fos也主要存在于脊髓背角i和ii层)引起广泛的生物学效应,介导了突触可塑性改变和中枢敏化形成痛觉过敏,phn大鼠的痛觉阈值降低了。⑷phn中起调控作用的是inos而不是nnos或者enos。在鞘内应用诱导型一氧化氮合酶inos清除剂或抑制剂,模型大鼠的机械痛觉阈值逐渐恢复至正常水平;在经鞘内应用内皮型eNOS或神经元型一氧化氮合酶nNOS清除剂或抑制剂,模型大鼠的机械痛觉阈值并未发生多大改变。这说明大鼠脊髓背角iNOS的表达活性(而不是nNOS或eNOS)与带状疱疹后遗神经痛即PHN的机械痛觉阈值变化之间可能存在一定的因果关系。本实验研究发现诱导型一氧化氮合酶iNOS参与并在PHN痛觉过敏和异常疼痛的形成过程中扮演了重要角色。这加深了我们对PHN病理发生机制的进一步认知,对于预防和治疗带状疱疹后遗神经痛提供新的更为合理的理论补充。临床上在开发新一代的镇痛药物方面具有实际意义[1]。这无疑对临床患者来说是个好消息。
【关键词】：疼痛 带状疱疹 脊髓背角 一氧化氮 诱导型一氧化氮合酶
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R752.12;R-332
【目录】：

• 缩略语表4-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-17
• 前言17-18
• 文献回顾18-28
• 实验一 带状疱疹后遗神经痛大鼠模型的建立28-37
• 1 材料28-29
• 2 方法29-33
• 3 结果33-35
• 4 讨论35-37
• 实验二 PHN状态下i NOS在脊髓背角的表达37-57
• 1 材料37-39
• 2 实验设计及方法39-48
• 3 结果48-52
• 4 讨论52-57
• 实验小结57-58
• References58-62
• 个人简历及研究成果62-63
• 致谢63

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