大鼠FcγRⅡB慢病毒载体的构建及其对imDC细胞抗原呈递作用影响的初步研究

发布时间：2020-06-18 18:31

【摘要】：目的:完成大鼠FcγRIIB慢病毒诱导表达载体的构建,并且对大鼠FcγRIIB慢病毒诱导表达载体在HT-1080细胞表面是否能够稳定、可控地表达进行检验,并开始对FcγRIIB慢病毒诱导表达载体转染不成熟树突状细胞后,对其抗原呈递功能的影响进行研究。方法:以Lewis大鼠m RNA为模版逆转录获得FcγRIIB基因片段,在慢病毒表达质粒TRE中克隆插入FcγRIIB基因片段,完成FcγRIIB慢病毒表达重组质粒的构建。使用FcγRIIB慢病毒表达重组质粒与Lenti-X HTX慢病毒包装系统转染HEK293T细胞,收获表达病毒。将慢病毒调节质粒Tet-on3G与Lenti-X HTX包装系统转染HEK293T细胞,收获调节病毒。表达病毒和调节病毒共感染HT-1080细胞,免疫荧光观察HT-1080细胞,在强力霉素(Dox)梯度浓度的诱导下FcγRIIB的表达。培养DA大鼠骨髓来源不成熟树突状细胞(Immature dendritic cell imDC),流式细胞检测经过免疫磁珠分选的imDC的纯度;流式细胞检测磁珠分选后imDC表面共CD80、CD86、CD40、MHC-II表达量。表达病毒与调节病毒共感染imDC,并加入不同浓度Dox对imDC诱导,免疫荧光染色观察imDC细胞表面FcγRⅡB的表达;流式细胞检测转染后imDC细胞表面FcγRIIB的表达率;Western blot法在转录后蛋白水平对FcγRIIB的表达进行检测,流式细胞术检测转染后imDC表面CD80、CD86、CD40、MHC-II在细胞表面表达。结果:利用PCR、多克隆位点酶切及DNA测序技术对重组质粒进行鉴定,测序结果表示目的片段DNA序列与Gene Bank显示的FcγRIIB基因序列经过Blast比对同源性达100%。病毒感染后的HT-1080细胞,经Dox诱导表达FcγRIIB,免疫荧光检测数据显示,慢病毒载体可以使目的基因FcγRIIB在HT-1080细胞可控地表达。不成熟树突状细胞磁珠分选后流式检测结果:OX62阳性表达率:93%;流式检测细胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40、MHC-II阳性表达率分别是11.6%、11.48%、9.25%、12.35%。免疫荧光结果验证了imDC细胞经过病毒转染后,能够上调FcγRIIB在其表面的表达;流式细胞检测FcγRIIB表达水平与诱导剂剂量正相关;Western blot法结果显示FcγRIIB蛋白表达水平随诱导剂剂量增加而升高;流式细胞术检测诱导慢病毒转染imDC后细胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40、MHC-II类分子阳性表达率分别为6.44%、8.25%、5.38%、11.62%。结论成功构建了FcγRIIB慢病毒诱导表达载体。慢病毒感染大鼠骨髓来源不成熟树突状细胞后过表达FcγRIIB基因,并且能够下调不成熟树突状细胞的抗原提呈作用。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R346;R392
【图文】：

pLVX-TRE3G质粒物理图谱

TRE-FcγRIIB重组慢病毒表达质粒测序结果与GeneBankFcγRIIB序列的Blast比对结果

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

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2 孙卉;马海峰;曹秀琴;杨志伟;;上调小鼠骨髓来源树突状细胞FcγRⅡb表达可抑制其抗原提呈功能[J];细胞与分子免疫学杂志;2015年05期

3 刘慧宇;曹秀琴;杨志伟;;含人FcγRⅡB基因慢病毒的制备及其在HT-1080细胞中的表达[J];细胞与分子免疫学杂志;2014年06期

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本文编号：2719662