低剂量纳曲酮（LDN）对大鼠CIA关节炎模型的治疗作用及相关机制研究

发布时间：2020-06-18 19:58

【摘要】：目的:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫性疾病,在我国发病率和致残率均很高,严重降低患者生活质量。RA现阶段治疗以抗炎及免疫抑制为主,但其明显的毒副作用严重影响治疗效果,且易产生耐药性。因此深入探索RA并开发出新的治疗药物对于防治RA有着重要的理论意义及极大的临床价值。既往研究表明LDN通过与阿片受体结合调节T/B淋巴细胞增殖、巨噬细胞和DCs的功能与分化及相应炎性细胞因子的产生,从而对纤维多肌痛、多发性硬化、克罗恩病等自身免疫疾病发挥免疫调节作用,减轻病情严重程度达到临床缓解的目的。据报道LDN在治疗类风湿关节炎(RA)缓解关节炎症程度方面是有效的,但目前其疗效与具体机制并不十分明确,有待于未来进一步深入探索。因此本实验拟通过大鼠CIA关节炎模型实验,从以下三方面进行研究:1.不同浓度的纳曲酮体内腹腔注射,研究LDN是否可以减轻大鼠关节炎症及何种剂量LDN对缓解关节炎症的作用最为显著。2.研究LDN是以何种机制发挥其调节免疫减轻炎症的作用:是否与调节T淋巴细胞亚群、Th细胞亚群-Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞间的相互平衡关系及大鼠外周血清中细胞因子环境有关。3.探究LDN调控Th细胞分化及炎症细胞因子表达和局部减轻关节软骨及骨组织损伤的具体机制。上述研究为LDN可能作为单独应用或辅助治疗等方式发挥免疫调节作用缓解关节炎严重程度奠定坚实理论基础,可能对传统控制病情药物及生物制剂未见到明显疗效的RA患者提供一个新的治疗方法。研究方法:1.取70只3-4周龄(体重100g左右)的雌性wistar大鼠,随机分为6组,除空白对照组10只,其余均建立CIA关节炎模型并剔除造模未成功者,保证每组至少10只,随机选取一组为CIA对照组,余下4组每天分别予以不同剂量的NTX:1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg及20mg/kg,观察大鼠体毛色泽及其活动状态,称量并记录体重,依据关节肿胀及活动等情况评估及记录大鼠关节病变的严重程度;4周后处死大鼠取膝关节滑膜及后足踝关节,HE染色观察病理学变化并进行评分明确炎症损伤程度。2.明确LDN在大鼠CIA关节炎模型中减轻炎症的作用及确定最佳作用浓度后,提取各组大鼠脾内淋巴细胞,应用流式细胞术检测大鼠脾脏组织内淋巴细胞亚群的数量及变化:CD4~+/CD8~+T细胞,Th1/Th2细胞和Th17/Treg细胞;同时取大鼠的外周血清,应用ELISA方法检测外周血清中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12及IL-17的表达水平变化情况。3.前期实验表明LDN可调节T细胞平衡及炎症细胞因子的释放,本实验进一步探索在不同组织中LDN与何种阿片类受体相互作用介导何种下游信号通路调节免疫反应减轻局部关节炎症的。应用实时PCR及免疫组化染色方法检测大鼠关节滑膜组织中阿片受体MOR、KOR及DOR的mRNA及蛋白的表达情况,实时PCR及蛋白免疫印迹方法检测大鼠脾脏组织中阿片受体MOR、KOR及DOR的mRNA及蛋白的表达情况,且进一步通过蛋白免疫印迹方法检测大鼠脾脏及关节滑膜组织中TLR4、RANKL及NF-κB的蛋白表达情况来探索调节全身免疫反应减轻局部炎症的作用机制。结果:1.LDN给药组中10mg/kg组体重与健康对照组相比减轻最少,与其余给药组和CIA组相比有所增加,关节炎炎症较其余给药组和CIA组减轻,滑膜及关节组织HE染色评分最低,故提示一定浓度的LDN可缓解大鼠关节炎的严重程度,并且以浓度为10mg/kg剂量时作用最佳,关节滑膜组织炎症程度最轻。2.在10mg/kg给药组中,流式细胞术提示大鼠脾脏淋巴细胞中CD4~+T细胞增多,CD8~+T细胞减少,CD4~+/CD8~+T细胞比例上升;Th1细胞减少,Th2细胞增多,Th1/Th2比例降低;Th17细胞减少,Treg细胞增多,Th17/Treg比例降低;而外周血清中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12及IL-17表达降低,细胞因子IL-10表达增加;提示一定浓度的LDN可调节T淋巴细胞及Th细胞亚群的平衡调节免疫反应重建免疫耐受减轻炎症,并且可以降低大鼠外周血清中促炎症细胞因子的表达,增加抑制炎症细胞因子释放从而缓解病情;进而进一步验证LDN浓度为10mg/kg时作用时效果最佳。3.结果提示脾脏中MOR与DOR高表达,关节滑膜组织中高表达KOR和DOR;脾脏及滑膜组织中虽然与健康对照组相比TLR4表达增加,但在LDN给药组中TLR4表达与CIA组相比明显下降,提示LDN与脾脏及滑膜组织中相应阿片受体相结合抑制TLR4表达从而减轻炎症反应的;脾脏及滑膜中NF-κB的表达与CIA组相比有着显著降低,而与健康对照组相比表达则增强;且关节滑膜组织中的RANKL表达也与CIA组相比有着显著降低,与健康对照组相比表达则增强,提示LDN可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减少促炎症细胞因子分泌以及调节Th17/Treg平衡抑制Th17分化从而调节全身免疫反应减轻炎症;同时在关节滑膜组织中LDN可能通过抑制TLR4表达抑制下游RANKL最终介导NF-κB信号通路减少破骨细胞分化降低关节中骨及软骨组织的侵蚀程度。结论:1.LDN可缓解大鼠关节炎的严重程度,以浓度为10mg/kg剂量时作用最佳,关节滑膜组织炎症程度最低;2.LDN可通过调节T淋巴细胞亚群:CD4~+/CD8~+T细胞,Th1/Th2细胞和Th17/Treg细胞的平衡,以及降低促炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12及IL-17表达,增加抑炎症细胞因子IL-10表达,进而调节免疫重建免疫耐受减轻炎症反应。3.LDN在脾脏中可能与MOR与DOR相结合制TLR4/NF-κB信号通路减少促炎症细胞因子分泌以及调节Th17/Treg平衡抑制Th17分化从而调节全身免疫反应减轻炎症;同时可能与关节滑膜组织中KOR和DOR结合通过抑制TLR4/RANKL/NF-κB信号通路减少破骨细胞分化减轻关节中骨及软骨组织的侵蚀程度。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.22;R-332
【图文】：

病理学变化,关节炎,组图,大鼠

图 2 A：健康对照组，B：CIA 造模组图 3 关节炎评分变化3.3 大鼠关节滑膜组织病理学变化0 2681 01 21 41 63 4 5 6 7A I s c o r i n gw e e kscore1 m g / k g5 m g / k g1 0 m g / k g2 0 m g / k gC I ADifferences betweengroupspvalue1mg/kg vs CIA --5mg/kg vs CIA p<0.0510mg/kg vs CIA p<0.0520mg/kg vs CIA p<0.055mg/kg vs 10mg/kg p<0.05

空白图,踝关节,视野,大鼠

图 5 大鼠踝关节 HE 染色，A-B 分别为 1mg/KG 组 50 倍 100 倍视野，C-D 为 5mg/KG 组同理，E-F 为 10mg/KG 组同理，G-H 为 20mg/KG 组同理，I-J 为 CI 造模组同理，K-L 为空对照组同理表 3 关节 HE 染色评分第三周第四周第五周第六周1mg/kg 组 2.3±0.67 3.4±0.52 4.7±0.48 5.8±0.425mg/kg 组 1.1±0.48 2.3±0.70 3.9±0.67 5.0±0.7010mg/kg 组 0.8±0.63 2.0±0.67 3.5±0.71 4.2±0.7920mg/kg 组 1.3±0.57 2.4±0.67 3.7±0.57 4.6±0.67CIA 对照组 1.8±0.79 3.0±0.47 4.4±0.70 5.5±0.536H E S c o r i n g56H E S c o r i n g1 m g / k g5 m g / k g

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