基于时间分辨荧光免疫层析快速定量检测降钙素原（PCT）试剂的研究
发布时间：2020-06-19 23:43
【摘要】：背景:感染性疾病是临床上的常见病,发病率呈逐渐上升的趋势,严重的感染患者会发生感染性休克。不同类型的感染性疾病的治疗方案也不同,细菌感染需要及时采用抗生素进行治疗,非细菌性感染则应慎用抗生素治疗。脓毒血症是一种死亡率较高的疾病,是非心脏内科ICU病人死亡的主要原因,我国估计约300万例/年,死亡率40%-50%。不能接受有效的抗生素治疗,患者的死亡风险逐渐上升,每推迟一小时,死亡率将增加7.6%。因此对这些感染性疾病进行早期的鉴别诊断,选择合适的治疗方案显得非常重要。降钙素原(procalcitonin,PCT)作为脓毒血症、炎症的一个良好血清学标志物,有助于临床感染性疾病的鉴别诊断及其预后评估,指导抗生素使用。目前PCT的检测方法主要有定量法(化学发光法、酶联免疫发光分析法)和半定量法(胶体金法)。化学发光法、酶联免疫发光分析法能准确定量,化学发光法需要大型专用仪器、费用昂贵、使用不便,酶联免疫发光分析法操作繁琐,准确性影响因素较多等缺点,限制了使用范围。胶体金法快速简便,但是不能精确的定量。PCT的动态监测和早期检测在临床上的价值意义重大,因此需要建立一种能快速、简便、准确对PCT定量的方法。目的:建立一种适用于床旁检测(Point of care testing,POCT)又称为“即时检验”的快速定量检测方法以助于PCT的及时检测和动态监测。本研究采用时间分辨结合免疫层析技术,建立一种快速定量检测PCT的方法。方法:1.将购买的两对PCT特异性单克隆行标记和包被抗体配对组合,用时间分辨免疫荧光分析法(TRFIA,Time-resolved fluoroimmunoassay)进行筛选,获取最佳的标记及包被抗体。2.应用双抗体夹心法,建立基于时间分辨荧光免疫层析快速定量检测降钙素原(PCT)试剂的方法。对各项试剂参数进行优化包括:硝酸纤维膜(NC膜)的筛选、检测线(T)和质控线(C)包被抗体量、最佳的划线量、标记抗体最佳用量、最佳反应时间确定。3.对试剂性能指标评估,进行以下实验:标准曲线、分析灵敏度、准确度、精密度、特异性、临床考核实验。结果:1.通过TRFIA法,综合剂量-反应曲线相关系数(r)、信噪比、背景等,筛选最优的标记原料(MJ03);包被原料(16B5)。2.确立基于免疫层析技术与时间分辨技术反应模式;最佳的硝酸纤维膜HF135膜;检测线(T)16B5最佳包被用量2.0mg/mL;质控线(C)山羊抗兔IgG最佳包被用量1.0mg/mL;最优划线喷速0.08μL/mm;标记抗体MJG03最佳用量为0.1mg/mL;兔IgG最佳用量为0.1mg/mL;最佳反应时间为15min。3.试剂性能指标评估:标准曲线回归方程:log(y)= 1.1143+0.8529log(x),r=0.9994;分析灵敏度为0.08ng/mL;准确度(回收率)在93%～105%之间;分析、分析间精密度CV在5.4%～13.4%;检测样本时不受人降钙素、CRP、人抗钙素、IL-6干扰物质的影响;234例临床样本考核实验等效性对比研究表明,自制试剂盒和商品化试剂盒(Roche Elecsys BRAHMS PCT Kit)具有很好的一致性(Kappa =0.875)和相关性[r = 0.977,(P0.01)]。结论:本研究成功研制了基于时间分辨荧光免疫层析技术快速定量检测PCT的试剂,试剂各项参数、性能指标良好,均符合体外诊断试剂的要求。能很好的满足临床对PCT快速定量检测的需求。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：
长和发射波长间Ｓｔｏｃｋｓ位移较大。利用光谱分辨技术和时间分辨技术可有效减逡逑少外界焚光、激发光及非特异性焚光的干扰，增强检测仪器的灵敏度。Ｅｕ３＋的主逡逑要特征：Ｓｔｏｃｋｓ位移较大（见图２），图上所见Ｅｕ３＋的激发波长峰值为３３７ｎｍ，逡逑发射波长峰值为６１３ｎｍ，邋Ｓｔｏｃｋｓ位移达到２７６ｎｍ，而普通荧光物质的Ｓｔｏｃｋｓ位逡逑移只有几十纳米，激发光与发射光发生部分重叠，引起相互干扰。荧光持续时间逡逑长（见图３），Ｅｕ３＋螯合物的荧光衰变时间较长，可以达到数百微秒，而普通荧光逡逑基团只有１？１００l枺庋局幸恍┑鞍子馐倜芏蹋鲇校保浚保盎Ｊ实毖渝义铣俨饬渴奔洌上鞍妆尘坝獾母扇牛迪指咝旁氡龋獗Ｖち耸奔浞直嬗义瞎夥治黾际醯母吡槊舳群偷透扇拧Ｊ奔浞直嬗夥治黾际酰ǎ裕遥校桑粒┘扔蟹派涿忮义弦叻治黾际酰ǎ遥桑粒┑母吡槊舳龋钟杏獗昙敲庖叻治觯ǎ疲桑粒┎僮骷虮悖戾义辖葑远扔诺悖谏锖土俅擦煊蛴泄憷那熬啊ｅ义纤孀偶觳饧际醯姆⒄
本文编号：2721512
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：
长和发射波长间Ｓｔｏｃｋｓ位移较大。利用光谱分辨技术和时间分辨技术可有效减逡逑少外界焚光、激发光及非特异性焚光的干扰，增强检测仪器的灵敏度。Ｅｕ３＋的主逡逑要特征：Ｓｔｏｃｋｓ位移较大（见图２），图上所见Ｅｕ３＋的激发波长峰值为３３７ｎｍ，逡逑发射波长峰值为６１３ｎｍ，邋Ｓｔｏｃｋｓ位移达到２７６ｎｍ，而普通荧光物质的Ｓｔｏｃｋｓ位逡逑移只有几十纳米，激发光与发射光发生部分重叠，引起相互干扰。荧光持续时间逡逑长（见图３），Ｅｕ３＋螯合物的荧光衰变时间较长，可以达到数百微秒，而普通荧光逡逑基团只有１？１００l枺庋局幸恍┑鞍子馐倜芏蹋鲇校保浚保盎Ｊ实毖渝义铣俨饬渴奔洌上鞍妆尘坝獾母扇牛迪指咝旁氡龋獗Ｖち耸奔浞直嬗义瞎夥治黾际醯母吡槊舳群偷透扇拧Ｊ奔浞直嬗夥治黾际酰ǎ裕遥校桑粒┘扔蟹派涿忮义弦叻治黾际酰ǎ遥桑粒┑母吡槊舳龋钟杏獗昙敲庖叻治觯ǎ疲桑粒┎僮骷虮悖戾义辖葑远扔诺悖谏锖土俅擦煊蛴泄憷那熬啊ｅ义纤孀偶觳饧际醯姆⒄
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