苹果酸合成酶Glcb基因克隆及表达特性研究

发布时间：2017-03-28 19:17

  本文关键词：苹果酸合成酶Glcb基因克隆及表达特性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：结核病(tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的慢性传染性疾病,结核杆菌被巨噬细胞吞噬后,在巨噬细胞内转为持留状态,通过乙醛酸循环途径获取能量,维持其在宿主体内的长期持留存在。苹果酸合成酶(Malate Synthase,MS)是一由GlcB基因编码而成,在乙醛酸循环途径中的关键限速酶之一,对结核杆菌维持其持留状态起决定性作用,因此本研究以这一关键酶为研究对象。本文以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,通过PCR反应扩增该菌株的GlcB基因,并将测序正确的GlcB基因,克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,取名为pET28-glcb。重组苹果酸合成酶在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。本研究成功克隆表达了结核分枝杆菌H37Rv苹果酸合成酶酶基因,最佳的诱导表达条件确定为在温度为20℃,IPTG终浓度为0.6 mM,诱导表达8 h,GlcB蛋白表达量达到最大。以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化异柠檬酸裂解酶重组蛋白,以含200 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来,经SDS-PAGE鉴定,获得了纯度较高的MS重组蛋白。采用超微量分光光度计实时监测418 nm处光吸收值的变化来计算MS的酶活性。最终计算结果酶活性为6.6μmol/(min·mg)。同时,采用Discovery Studio 2.1模拟多肽与MS蛋白晶体(3S9I)进行分子对接,最终对接结果确定以下两条七肽链,命名及氨基酸序列分别为:3号:RMHSSYH;113号:PSREPPN。采用固相合成法合成以上两条七肽链,经质谱检测是正确的。将合成正确的两条七肽链分别与苹果酸合成酶作用,检测所合成的肽对MS具有抑制作用,抑制作用的检测结果为,113号肽对MS的抑制作用最强,抑制率达到了68.01%;3号肽,抑制率为63.98%。本研究为新型肽类抗结核药物的研究和发展提供了先导化合物,为新型抗结核药物的筛选和进一步的研究提供了实验数据。
【关键词】：结核分枝杆菌 Glcb 苹果酸合成酶 表达特性 活性
【学位授予单位】：长春工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.911;Q78
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 绪论8-18
• 1.1 结核杆菌的简介8-9
• 1.2 结合分枝杆菌持留性9-10
• 1.3 苹果酸合成酶的简介10-14
• 1.3.1 苹果酸合成酶的编码基因及蛋白结构10-11
• 1.3.2 苹果酸合成酶Glc B基因表达条件11-12
• 1.3.3 苹果酸合成酶的催化机理12-13
• 1.3.4 金属离子、p H值对苹果酸合成酶酶活力的影响13
• 1.3.5 苹果酸合成酶在乙醛酸循环过程中的作用13-14
• 1.4 多肽药物的研发14-15
• 1.4.1 多肽药物特点14
• 1.4.2 多肽药物靶点14-15
• 1.5 抗结核病多肽药物的研发15-16
• 1.5.1 抗结核多肽药物靶点的研究现状15-16
• 1.5.2 以苹果酸合成酶为药物靶点开发可能性16
• 1.6 药物模拟筛选16-17
• 1.7 小结17-18
• 第二章 材料和方法18-35
• 2.1 主要材料18-20
• 2.1.1 试剂及仪器18-20
• 2.1.2 菌株及质粒20
• 2.2 培养基与溶液配制20-21
• 2.3 H37RV菌株的培养21-22
• 2.4 基因组DNA提取22
• 2.5 PCR扩增目的基因及回收纯化22-25
• 2.5.1 引物设计22-23
• 2.5.2 PCR反应体系及条件23
• 2.5.3 琼脂糖凝胶电泳：23-24
• 2.5.4 目的基因回收、纯化24-25
• 2.6 载体构建、转化及筛选25-28
• 2.6.1 克隆载体的构建26
• 2.6.2 表达载体的构建26-27
• 2.6.3 大肠杆菌感受态细胞的制备27
• 2.6.4 重组质粒转化27
• 2.6.5 重组质粒的蓝白斑筛选27-28
• 2.7 质粒提取、纯化及酶切鉴定28-30
• 2.7.1 碱法小量提取质粒及纯化28
• 2.7.2 碱法大量提取质粒及纯化28-29
• 2.7.3 质粒的酶切鉴定29-30
• 2.8 目的蛋白的诱导表达与纯化30
• 2.8.1 IPTG诱导转化菌表达苹果酸合成酶30
• 2.8.2 Glc B蛋白表达产物的纯化30
• 2.9 Glc B蛋白诱导表达及纯化产物的鉴定30-32
• 2.10 GLCB蛋白的活性检测32-33
• 2.11 分子对接模拟33
• 2.12 多肽合成、纯化鉴定及其抑制检测33-35
• 第三章 实验结果35-50
• 3.1 GLCB基因提取及测序鉴定35-38
• 3.1.1 提取结核分枝杆菌的基因组与设计Glc B基因PCR引物35
• 3.1.2 GlcB基因PCR扩增结果35-36
• 3.1.3 pUM-T质粒与目的基因连接以及测序结果36-38
• 3.2 PET28A（+）-GLCB重组原核表达质粒的构建38-39
• 3.2.1 pET-28a（+）-glcb重组质粒鉴定结果38-39
• 3.3 SDS-PAGE鉴定重组表达产物的结果39-40
• 3.4 SDS-PAGE鉴定产物诱导表达条件40-43
• 3.4.1 不同诱导时间对MS表达的影响40-41
• 3.4.2 不同诱导剂浓度对MS表达的影响41-42
• 3.4.3 不同诱导温度对MS表达的影响42-43
• 3.5 SDS-PAGE鉴定表达产物存在形式43-44
• 3.6 目的蛋白纯化条件优化44-45
• 3.7 重组MS的酶活性测定45
• 3.8 分子对接结果45-47
• 3.9 肽的固相合成鉴定及抑制作用47-50
• 3.9.1 合成肽的纯化及质谱鉴定47-48
• 3.9.2 合成肽对MS抑制作用检测48-50
• 第四章 讨论50-54
• 第五章 结论54-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-62
• 作者简介62
• 攻读硕士学位期间研究成果62

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