铁离子对破骨细胞分化及骨吸收影响的机理研究

发布时间：2020-06-25 05:17

【摘要】：目的：探讨铁离子（Ferric ion）在破骨细胞分化过程以及骨吸收中的作用，同时阐述其中可能存在的机理，以进一步阐明铁代谢与骨代谢之间的关系。方法：1.以RAW264.7作为破骨细胞前体细胞，以枸橼酸铁铵（ferric ammoniumcitrate, FAC）作为三价铁离子供体，首先研究12uM、25uM、50uM、100uM、200uMFAC对RAW264.7增值活力的影响。2.在20ng/ml核因子κB受体活化因子配体（RANKL）存在下，根据实验1结果选取12uM、25uM、50uM FAC干预RAW264.7，抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）观察TRAP阳性细胞形成情况并计数（以细胞核≥3个为TRAP阳性细胞，即破骨细胞）。3.以2,7-DCF-DA作为细胞内荧光探针，流式细胞仪检测不同浓度FAC以及FAC联合RANKL干预RAW264.7后细胞内活性氧（Reactive oxygen species/ROS）水平。4.检测FAC联合RANKL干预后破骨细胞内总谷胱甘肽含量，以及还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比值（GSH/GSSG）。5.利用N-乙酰-半胱氨酸（NAC）作为抗氧化剂，观察FAC联合NAC干预后对破骨细胞形成的影响。6.分别用RT-PCR、Western blot检测FAC以及FAC+NAC干预RAW264.7后TRAP、Cathepsin-K、NFATc1表达变化情况。7.选取24只雄性ICR小鼠，随机分为3组，分别腹腔注射生理盐水、FAC、FAC+NAC，建立对照组、高铁组、高铁+抗氧化剂组小鼠模型。干预完成后取小鼠骨髓源性单核细胞进行破骨细胞培养，观察不同组别破骨细胞形成情况。8.取各组小鼠股骨进行HE染色观察骨小梁情况。9.用Miro-CT对各组小鼠股骨远端及股骨中段进行扫描，并进行三维图像重建，分析各参数值。10.留取各小鼠血清，酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中铁蛋白（Ferritin）、丙二醛（MDA）、8-羟基-鸟苷（8-OH-DG）、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRAP-5b）、一型胶原C端肽（CTX）、核因子κB受体活化因子配体/骨保护素（RANKL/OPG）、骨碱性磷酸酶（BALP）、骨钙素（BGP）水平。结果：1.12uM、25uM、50uM FAC对RAW264.7增值无抑制作用（P0.05），100uM、200uM FAC对RAW264.7有抑制作用（P0.05）。2. FAC能在一定范围内（0uM、12uM、25uM、50uM）促进破骨细胞（TRAP阳性细胞）形成（P0.05）。3. FAC能在一定范围内提高细胞内活性氧，同时FAC和RANKL联合干预也能提高RAW264.7细胞内活性氧水平（P0.05）。4. FAC联合RANKL干预RAW264.7细胞后，细胞内总谷胱甘肽含量下降（P0.05），GSH/GSSG上升（P 0.05）。5.抗氧化剂NAC能部分抑制FAC对破骨细胞形成的促进作用（P 0.05）。6. RT-PCR、Westernblot结果提示FAC能上调TRAP、Cathepsin-K、NFATc1的表达（P0.05），NAC能部分抑制FAC介导的这一作用（P 0.05）。7.利用动物模型骨髓源性单核细胞培养破骨细胞结果提示，高铁组动物模型骨髓源性单核细胞形成的破骨细胞显著多于正常对照组（P 0.05），而铁离子和NAC联合干预组形成的破骨细胞少于高铁组（P0.05）。8.高铁组小鼠股骨远端骨小梁较对照组稀疏，而NAC和铁离子联合干预组小鼠股骨远端骨小梁密度高于高铁组。9. Micro-CT对小鼠股骨远端分析结果提示，高铁组小鼠股骨远端微观结构较对照组退变明显，而NAC与铁离子联合干预组小鼠股骨远端骨微观结构退变较轻。10.高铁组小鼠血清中Ferritin、MDA、8-OH-DG、TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG显著高于对照组（P0.05），而NAC和铁离子联合干预组MDA、8-OH-DG、TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG显著低于高铁组（P0.05）；相反，高铁组小鼠血清中BALP、BGP含量明显低于对照组（P0.05），而铁离子和NAC联合干预组血清中BALP、BGP含量显著高于高铁组（P 0.05）。结论：铁离子能促进破骨细胞的分化，同时能在体内增强骨吸收；这一作用可能与铁离子能促进活性氧形成，提高体内氧化应激水平有关。铁离子对骨吸收的促进作用是其引起骨质疏松的重要因素，抗氧化剂可能通过抑制铁离子介导的骨吸收增强在铁过载骨质疏松防治方面起到一定的作用。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329
【图文】：

活力,破骨细胞形成,细胞活性,两两比较

数±标准差表示，采用 SPSS13.0 软件统计包进行分析，两两比较采用 SNK 检验，P 值< 0.05 为有统铵对 RAW264.7 细胞活性的影响果提示，与对照组即 0uM FAC 干预组相比，12、长活性基本无影响，即既不会促进细胞增殖，也不00uM 开始，FAC 开始对 RAW264.7 细胞生长起抑们在接下来的实验中选取 12、25、50uM FAC 干预破骨细胞形成的影响，从而排除了铁离子对破响。

破骨细胞,破骨细胞形成,倒置显微镜,形态

在培养基中加入 RANKL 诱导 RAW264.7 向破骨细胞分化。约 2-3 天单核融合，有体积稍大的破骨细胞形成。约 4-6 天后可见光镜下可见较大的破成，其体积是正常 RAW264.7 细胞的数十倍，甚至上百倍、上千倍，破骨各异，可为圆形、椭圆形、香蕉形等。因为破骨细胞实质上是单核细胞融所以破骨细胞的形状取决于参与融合的单核细胞中外围单核细胞所形成另外破骨细胞细胞核常大于等于 3 个，且细胞核较大，光镜下折光性强。加诱导剂的 RAW264.7 细胞，细胞较小，呈梭形，图 2B 中红色箭头所指的较大的破骨细胞。培养完成后细胞经抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，如图 2C 所示，KL 的 RAW264.7 的细胞无抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞形成，细胞较小。而如图 2D 所示体积巨大的染色为酒红色的破骨细胞形成，且细胞核多即为抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞。

【参考文献】