牛泡沫病毒感染性克隆的构建及附属蛋白功能分析

发布时间：2020-07-02 14:15

【摘要】：泡沫病毒(foamy virus, FV)泛指反转录病毒科中泡沫病毒亚科的病毒,与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type1, HIV-1)和人T细胞白血病病毒(human T-cell leukemia virus, HTLV)的基因组结构类似,属于复杂的反转录病毒。泡沫病毒具有独特的进化地位、潜在的致病性及可能改建为优良的基因转移载体等特点,近年逐渐引起各国疾病防控机构及从事病毒学及免疫学基础研究学者的重视。学界对灵长类泡沫病毒的研究较为深入,对于非灵长类泡沫病毒的研究相对肤浅,主要涉及猫泡沫病毒(feline foamy virus, FFV)和牛泡沫病毒(bovine foamy virus, BFV)。我室在上世纪九十年代自主分离到一株中国株牛泡沫病毒3026(BFV strain3026, BFV3026),随之对其基因功能及其与宿主关系开展系列研究。本文以经过实验室长期培养的BFV3026为出发材料,构建多株BFV3026原病毒全长基因组DNA感染性克隆(pBS-BFV),筛选获得了高复制活性的感染性克隆(pBS-BFV-B);通过与实验室前期获得的低活性基因组全长DNA克隆(pBS-BFV-Y)进行基因嵌合比较,对影响该病毒复制活性的关键因素进行了分析：发现BFV附属蛋白BTas的反式激活的能力与pBS-BFV的复制水平密切相关；分子机制探究结果显示：其第108位氨基酸是DNA结合结构域中的关键氨基酸之一,Asp108突变为Asn显著增强BTas蛋白与Tas应答元件(Tas-responsive element, TRE)的相互作用,提高了BTas蛋白反式激活能力,是该感染性克隆具有高复制活性的主要原因；随之,使用稳定整合BFVLTR-GFP的BFV指示细胞系(BFV indicator cell line, BICL)进行了cell-freeBFV3026筛选实验,获得了cell-free BFV3026感染性病毒颗粒,滴度约为1×104TCID50/mL;最后,对病毒另一附属蛋白BBet的功能进行反向遗传学研究：证实BBet蛋白在BFV3026早期具有负调控功能。本研究获得的高活性BFV3026感染性克隆及cell-free的BFV3026毒株,为深入研究BFV3026的分子生物学特征及构建基因转移载体准备了良好的实验材料；利用反向遗传学方法,在病毒水平探索了BFV3026附属蛋白BTas和BBet在病毒复制过程中的功能,为深入解析BFV的附属基因的功能及其对复制特征影响提供了重要实验依据,提示了分析BFV潜在致病性改变可能的研究方向。相关研究结果为解析泡沫病毒独特的基因表达调控机制提供依据,为全面认识反转录病毒及相关重要致病病毒的致病机理提供新视角,同时可作为将泡沫病毒改建为基因转移载体的理论依据。
【学位授予单位】：南开大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373
【图文】：

泡沫病毒,进化树

第一章引言生的细胞病变效应（cytopathic effects, CPE)，使得病变细胞在光镜下成泡沫丨2]。次年，一株病毒从恒河猴体内分离出来，被命名为猴泡沫病毒I型（simianamy virus type 1, SFV-1 ) [3]。泡沫病毒在发现之初并未引起人们足够的注意，至上世纪七十年代初，从一位患有鼻咽癌的肯尼亚人体内分离出一株泡沫病，起初被命名为人泡沫病毒（human foamy vim, HFV) [4],后续的序列比对分表明这株HFV与来自肯尼亚的SFVcpz的同源性最高[5]，因此人们将HFV的命修改为原型泡沫病毒（prototype foamy virus, PFV) [6]。虽说未发现真正的FV，但文献报道PFV可经人畜传染并在人体内复制8]。PFV是泡沫病毒的模毒株，是人们最了解的泡沫病毒之一，是第一个被克隆并获得全长序列和感性克隆的泡沫病毒泡沫病毒广泛分布在脊椎动物中，如猫、牛、马及他非人类灵长类动物（如大srsr、非洲绿猴、狒沸、恒河猴等），许多新型泡沫病毒随后也被分1?出来（见表1.2)。 ,00 r SFVbab(14720) -

序列,泡沫病毒,基因组结构,转录产物

编码包装病毒所需要的结构蛋白与酶类，如衣壳蛋白，蛋白酶、反转录酶、整合酶和包膜蛋白（图1.3上部）[54]。此外，在em；和3' LTR之间有2-3个^u放阅读框（open reading frame，ORF)，编码病毒自身的反式转录激活因子Tas(transactivator of spumavirus)、Bet (between env and tas )等辅助蛋白[彡纟’ 56】(图1.3)。前病毒cDNA两端各有一个长末端重复序列（long terminal repeat, LTR),该序列承担着启动子和增强子双重功能。有别于其他的反转录病毒，人们在泡沫病毒中发现了除5’ LTR之外的第二个启动子，位于em；基因内部，调节蛋白Tas编码区的上游，被称为内部启动子（internal promoter, IP) [57]。此IP可指导病毒早期感染时Tas的转录、翻译

【参考文献】