基于转座子载体高压注射的免疫缺陷小鼠体内多种人淋巴因子长期表达策略的研究

发布时间：2020-07-02 16:13

【摘要】：研究目的:免疫系统人源化小鼠是研究最多应用最广的人源化小鼠之一,其特点是具有人的免疫系统,被认为是生物医药领域研究的理想小动物模型。经过几十年的研究和发展,该模型日趋成熟。但因缺乏某些人类细胞发育存活所必需的细胞因子,导致某些血系细胞重建效果不佳。有报道显示小鼠IL 4、GM-CSF、CSF、IL 3等细胞因子有种属特异性,与人类细胞无交叉反应。外源补充人IL15、EPO及IL 3给免疫系统人源化小鼠可增加人NK和红细胞的重建比例。因此,补充合适的细胞因子可弥补当前人源化小鼠模型髓系和红系细胞重建不佳的缺陷,使该模型得到更广泛的应用。因此本课题通过构建含有人IL 6、IL 3、IL 15、SCF、GM-CSF五种细胞因子的表达质粒,利用PiggyBac(PB)转座子体系将目的基因整合到宿主小鼠细胞基因组中实现长期表达,以此优化免疫系统人源化小鼠模型。研究方法:利用分子生物学手段构建含有人IL 6、IL 3、IL 15、SCF、GM-CSF五种细胞因子的表达质粒(PB-5F);经氨苄青霉素培养基筛选,挑取单克隆进行NheI和BamHI双酶切以及琼脂糖电泳筛选出含有目的基因大小的阳性克隆;阳性克隆送库美生物科技有限公司测序;采用细胞转染技术将含有绿色荧光蛋白基因的转座子质粒(PB-GFP)和PB转座酶质粒(Super PB)按2.5:1的比例共转染进入293T细胞系,利用倒置荧光显微镜和流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达;将目的质粒(PB-5F)(50μg/只)和Super PB(20μg/只)混合后高压注射入NCG免疫缺陷小鼠体内,在确定的时间点取小鼠血清,应用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分别检测5种细胞因子的表达、含量及持续时间。研究结果:PB-5F质粒经过双酶切和琼脂糖凝胶电泳证明,插入片段与目的基因5F片段大小相符,测序结果证明插入序列与5F基因序列一致。体外细胞转染实验显示,在细胞转染7天内瞬时转染组GFP阳性率与稳定转染组没有明显差异;随后瞬时转染组几乎检测不到GFP的表达,而稳定转染组可以维持30天以上的表达。小鼠血清中人的细胞因子在注射后第5天瞬时转染组和稳定转染组各细胞因子之间无统计学差异,与体外转染实验结果一致;2个月后稳定转染组依然能检测到人细胞因子的表达。研究结论:(1)成功构建了含有人IL 6、IL 3、IL 15、SCF、GM-CSF基因的PB转座子质粒PB-5F;(2)PB转座子体系可维持人类细胞因子在小鼠体内的长期表达。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：

图 2.2 多种人源化小鼠示意图[42]型的几类人源化小鼠模型。通过移植人的不同组织、细胞等构建不同种类的人源化小鼠模型，应用于人类相关领域研究。.2 免疫系统人源化小鼠模型的应用人源化小鼠的出现为医学研究提供了前所未有的机会。这些模型体积小容作，且繁育周期短。此外，人源化小鼠允许人类特异性病原体在其中感染和，并且能够针对一系列疾病开发功能性人类特异性免疫应答。许多疾病机制完全清楚，因此，利用人源化小鼠可以使研究人员了解促进医学问题发展的因素，包括传染病，自身免疫和癌症等。2.1 感染性疾病

图 2.3 各类细胞因子在造血过程中的作用[71]液淋巴系统发育和维持生存所需的关键因素的非详尽列表，颜色代码表人类和小鼠蛋白质之间氨基酸同一性的百分比。 DNA 的转座研究基因功能，在许多情况下需要在哺乳动物细胞内持续高水平的转基传统上应用逆转录病毒或慢病毒载体来实现稳定的转基因的表达[72]。然而毒介导的转基因表达常常处于较低水平，并且由于低拷贝和/或染色质而可以随时减少[73, 74]。DNA 转座子提供了永久修饰哺乳动物细胞基因组病毒方法[74]。转座因子或转座子（Transposable elements 或 Transponsons 于基因组中可自主移动或复制自己并整合到新位点的 DNA 片段[75]，位过程称作转座。自 20 世纪 40 年代美国女科学家 Barbara McClintock[76]

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 沈丹;谢雨t;李庆平;薛松磊;史云强;王赛赛;陈才;钱跃;高波;崔恒宓;宋成义;;多转座子载体的构建及转座特性比较研究[J];中国农业科学;2015年11期

2 郝景芳;;你永远不知道一样东西真正的用处[J];文苑(经典美文);2016年12期

3 倪欣涛;卢凤英;苗双;朱寅玉;邢林林;俞慧;祁晶晶;王桂军;胡青海;;鸭疫里氏杆菌转座子随机突变库的构建[J];中国兽医科学;2014年04期

4 李永文;姚毅冰;万海粟;周清华;;“睡美人”转座子及其在肿瘤研究中的应用[J];中国肺癌杂志;2008年06期

5 刘冬;;转座子在转基因动物中的应用[J];中国牧业通讯;2008年07期

6 黄春;张万江;;转座子及其相关技术的研究[J];世界华人消化杂志;2006年17期

7 王志耘;李文成;陶美凤;;一个链霉菌中微型转座子系统的构建[J];湖北农业科学;2006年06期

8 黄坤艳,饶力群,储成才;转座子标签法及其在水稻功能基因组研究中的应用[J];高技术通讯;2003年06期

9 廖鸣娟,董爱华,王正栋,朱睦元;植物转座子及其在功能基因组学中的应用[J];遗传;2000年05期

10 李凤玲,赵毓橘;植物转座子[J];植物生理学通讯;2000年05期

相关会议论文 前10条

1 高才华;肖美丽;任小东;Alice Hayward;殷家明;付东辉;李加纳;;真核生物基因组中嵌合转座子的特征分析和功能注释[A];中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编（2009-2013）[C];2013年

2 严冰;曾庆韬;钱远槐;;黑腹果蝇黑条体突变体中转座子分布的多样性研究[A];中国动物科学研究——中国动物学会第十四届会员代表大会及中国动物学会65周年年会论文集[C];1999年

3 钱跃;陈才;沈丹;薛松磊;王赛赛;史云强;高波;王宵燕;崔恒宓;宋成义;;九种硬骨鱼基因组转座子分布及扩增差异研究[A];遗传多样性：前沿与挑战——中国的遗传学研究（2013-2015）——2015中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2015年

4 周祥;白林泉;邓子新;;井冈霉素产生菌的全基因组转座子突变[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年

5 曲志才;姜曰水;;山东部分地区灰飞虱mariner类转座子研究[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编（2004-2008）[C];2008年

6 吴小锋;曹翠平;鲁兴萌;;利用细菌转座子构建适用于家蚕的快速杆状病毒基因表达系统[A];中国蚕学会第七届二次理事会暨学术年会论文集[C];2005年

7 徐小平;孔繁荣;蔡林;Shahin Oftadeh;周飞;Gwendolyn L.Gilbert;;红霉素耐药肺炎链球菌的血清型、耐药基因和转座子相关研究[A];首届中国临床微生物学大会（宁波会议）暨《医学参考报》微生物学与免疫学论坛论文汇编[C];2010年

8 张云峰;;小麦中转座子存在的可能性初探[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年

9 吴小锋;曹翠平;姚慧鹏;鲁兴萌;Mark Robertson;;利用细菌转座子构建适用于家蚕的快速杆状病毒基因表达系统[A];中国蚕学会第四届青年学术研讨会会议论文集[C];2004年

10 王晓明;王亚宾;胡功政;李新生;张素梅;潘玉善;商艳红;杜向党;;新型接合型转座子Tn6247的鉴定及分析[A];中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会论文集[C];2015年

相关重要报纸文章 前5条

1 记者 聂翠蓉;全基因组扩增实现百分之九十七覆盖率[N];科技日报;2017年

2 冯卫东;转座子荣居自然界最丰富基因榜首位[N];科技日报;2010年

3 本报记者 冯卫东;遗传基因中的“侵略者”[N];科技日报;2008年

4 记者 吴少敏 通讯员 蔡珊珊;发现6亿年前免疫“分子活化石”[N];南方日报;2016年

5 冯卫东;进化之旅：三十亿岁的DNA[N];中国航空报;2012年

相关博士学位论文 前10条

1 殷豪;梨基因组LTR反转座子注释及进化分析研究[D];南京农业大学;2014年

2 武红玉;二穗短柄草Ac/Ds转座体系的构建及其应用[D];山东农业大学;2018年

3 张化浩;家蚕基因组中转座子的水平转移[D];重庆大学;2014年

4 张森;利用转座子系统定向突变拟南芥基因以及拟南芥FA121和FA254两基因功能的研究[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2004年

5 龙丽坤;高压诱导水稻发生可遗传DNA甲基化变异和转座子mPing及Pong的转座激活[D];东北师范大学;2006年

6 李竹红;用转座子与RNA/DNA嵌合寡核苷酸探讨靶向性基因治疗[D];中国协和医科大学;2000年

7 丁f;piggyBac转座系统[D];复旦大学;2007年

8 单晓辉;菰DNA渐渗诱发水稻内源转座子mPing、Pong的转座激活[D];东北师范大学;2007年

9 沈野;菰DNA渐渗诱导水稻内源LTR类反转座子的遗传和表观遗传变异[D];东北师范大学;2008年

10 叶晨波;电击介导和Sleeping Beauty转座子介导的人凝血因子Ⅸ基因表达研究[D];复旦大学;2003年

相关硕士学位论文 前10条

1 李旭;石刁柏基因组转座子的组成与定位[D];河南师范大学;2018年

2 杨勤帅;转座子Tgm9的演化和应用[D];西北大学;2018年

3 常恩洁;大豆转座子Tgm9转座机制的研究[D];西北大学;2018年

4 占U

本文编号：2738400