三种膝关节骨性关节炎大鼠模型的比较研究

发布时间：2020-07-05 05:14

【摘要】：本课题组在临床研究的基础上预开展“温针灸对大鼠膝骨性关节炎软骨退变作用机制的研究”,在查阅文献时发现膝关节骨性关节炎造模方法较多,药物选择和用量、手术部位、模型形成时间上众说纷纭,差别较大,给骨性关节炎的基础研究带来较多问题。目的:本实验从文献中挑选出三种造模方法,其中药物注射法选取文献报道较多的4%的木瓜蛋白酶溶液、0.03mol/L的L-半胱氨酸溶液按2:1的比例混匀,以0.1mL/kg的量注射膝关节;手术法采用文献报道较多的前交叉韧带切断法及膝关节以屈曲位持续制动法。通过对SD大鼠膝关节骨性关节炎三种模型在各个时间段的效果比较,明确各组模型形成骨性关节炎的时间,并综合分析选择更为理想的动物模型,为下一步温针灸对大鼠膝骨性关节炎软骨退变作用机制的研究奠定基础。方法:将128只SPF级健康雄性SD大鼠随机分为A组空白组、B组制动组、C组木瓜蛋白酶组、D组手术组,每组32只,各组均以大鼠的右膝建立模型。B组将大鼠膝关节以屈曲位持续制动;C组将4%的木瓜蛋白酶溶液、0.03mol/L的L-半胱氨酸溶液按2:1的比例混匀,以0.1mL/kg的量于实验的第1、4、7天行右膝关节腔注射;D组采用ACLT法即前交叉韧带切断术;空白组大鼠只抓取。每天记录各组大鼠的一般状态,在实验开始的2、4、6、8周的最后一天,分四批处理各组大鼠,每组每次8只。进行行为学观察,对各组大鼠按LequesneMG法进行评分;用WAGNER压痛仪测大鼠痛阈;取大鼠右后肢进行影像学观察;取大鼠右膝关节,对软骨表面进行大体观察评分,HE染色切片并进行病理观察。结果:1.软骨大体观察评分、LequesneMG评分、痛阈各组组内比较:(1)A组大鼠整个实验过程中表现正常,右膝关节软骨表面均光滑、透明,各时间段右膝关节均未见肿胀,按压时未见明显疼痛反应,大鼠奔跑时踏地有力、步态正常,膝关节活动范围正常,整个实验过程中未见明显改变。大鼠在2、4、6、8周的痛阈相互比较,均无显著差异(P0.05),提示空白组未出现骨性关节炎的表现。(2)B组大鼠软骨大体观察评分、LequesneMG评分、痛阈在第2周、4周、6周差异性显著(P0.05),第8周与第2周、4周比较差异显著(P0.05),第6周与第8周比较差异不具有显著性(P0.05)。(3)C组大鼠LequesneMG评分、痛阈在第2周、4周、6周、8周差异性显著(P0.05);6周与8周软骨大体观察评分比较差异不具有显著性(P0.05),其余两两比较差异均显著(P0.05)。(4)D组大鼠软骨大体观察评分、LequesneMG评分、痛阈在第4周、6周时差异性不显著(P0.05),其余时间段两两相比差异均显著(P0.05)。2.软骨大体观察评分、LequesneMG评分、痛阈各组组间比较:(1)组间软骨大体观察评分比较:B、C、D组与A组在2、4、6、8周评分差异有统计学意义(P=0.0000.05),2、4周时B组评分高于其他两组,6周时三组评分区别不大、D组略高,8周时C、D组高于B组。(2)组间Lequesne MG评分比较:B、C、D组与A组在2、4、6、8周评分差异有统计学意义(P=0.0000.05),2、4周时D组评分高于其他两组,6、8周时B组相对较高。(3)组间痛阈的比较:(1)2周后B、C、D组与A组比较,P0.05,有统计学差异。C、D组与B组比较,P0.05,无统计学意义,C、D组比较,P0.05,有统计学差异。(2)4周后B、C、D三组与空白组比较痛阈明显降低,P0.05,有统计学差异。B、C、D组相互比较,P0.05,无统计学意义。(3)6周后B、C、D三组与空白组比较痛阈显著降低,P0.05,有统计学差异;B、C组、B、D组比较,P0.05,无统计学意义;C、D组比较,P0.05,有统计学差异。(4)造模8周后B、C、D三组与空白组比较痛阈显著降低,P0.05,有统计学差异;B、C、D组相互比较,P0.05,无统计学意义。3.大鼠膝关节正侧位X线片显示:(1)A组大鼠2、4、6、8周时膝关节正侧位片均未见明显异常。(2)B组大鼠2周时膝关节正侧位片均未见明显异常;4周时,髁间嵴有轻微增生;6周时,髁间嵴及胫骨内侧缘增生,关节面轮廓粗糙,关节间隙略变窄;8周时,关节内外侧间隙不一致、略有变窄,关节面不光滑、髁间嵴变尖,关节软骨高密度影。(3)C组大鼠2周时膝关节正侧位片均未见明显异常;4周时,髁间嵴有轻微增生;6周时,髁间嵴及胫骨内侧缘增生,关节面轮廓不光滑,关节间隙略显变窄;8周时,关节内外侧间隙不一致、有变窄,关节面不光整、髁间嵴变尖,关节软骨高密度影。(4)D组大鼠2周时,膝关节正侧位片均未见明显异常;4周时,髁间嵴有轻微增生,关节内外侧间隙一致,未见明显狭窄,骨性关节面较光滑、关节面轮廓清晰完整;6周时与4周表现基本一致;8周时,关节内外侧间隙不一致、有变窄,关节面不光整、髁间嵴变尖,关节软骨高密度影。4.软骨组织HE染色结果:(1)A组2、4、6、8周的HE染色切片均为观察到异常表现,软骨表层光滑平整,软骨细胞数量正常、分布均匀,排列整齐,层次清晰,无血管侵入,潮线完整,基质染色正常。(2)B组2周时,HE染色正常,软骨表层光滑整齐,软骨细胞数量正常且分布均匀,层次清晰,潮线完整,基质染色均匀、无失染;4周时,软骨表层不平整,无裂隙形成,弥漫性细胞过多,基质染色正常或轻染,镜下见软骨组织轻微损伤;6周时,镜下表现为中度损伤,软骨表层不平整,有裂隙达过渡带,细胞数目减少、排列不整齐,潮线有残缺,基质轻染;8周时,镜下观察为中度损伤,软骨表面不光滑,有达放射带的裂隙,细胞数目减少,基质轻染,潮线不完整。(3)C组注射木瓜蛋白酶后2周,光镜下未见明显异常;4周后,镜下观察有轻度损伤,软骨表层不平整,无裂隙形成,弥漫性细胞数量变多、分布不均,层次不清,潮线基本完整,基质染色不匀,镜下见软骨组织轻微损伤;6周后,镜下表现为中度损伤,软骨表层不光滑,细胞数目减少、排列不整齐,潮线有残缺,有血管翳形成,基质轻染;8周后,镜下观察为中度损伤,软骨表面不光滑,有达放射带的裂隙形成,细胞数目减少、排列不整齐,基质轻染,潮线不完整。(4)D组前交叉韧带切断后2周后,HE染色未见明显异常;4周后,关节软骨表现为轻微损伤,软骨表层不光滑,细胞有簇状分布,层次尚清晰,基质染色不均,潮线尚完整;6周后,表现为轻度损伤,软骨表层被破坏,细胞呈簇分布,基质轻染,潮线不完整;8周后,表现为中度损伤,软骨表面不光滑,局部有达辐射带的裂隙形成,细胞分布不均,基质染色浅,潮线不完整。结论:(1)制动法、关节腔注射木瓜蛋白酶法、前交叉韧带切断法均能成功建立与人类膝关节骨性关节炎相似的动物模型。(2)制动组大鼠持续制动4周后表现为早期骨性关节炎,6、8周相当于人类KOA中期;木瓜蛋白酶组与制动组类似,4周为早期,6、8周出现KOA中期表现;手术组4、6周为KOA早期,8周为中期。(3)关节腔注射木瓜蛋白酶法操作简便,动物生存质量相对较高,4周为KOA早期,6、8周为中期,是相对理想的造模方法。
【学位授予单位】：山西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R684.3;R-332
【图文】：

屈曲位,大鼠,粉剂,冷藏室

大鼠屈曲位制动图

过程图,切断术,前交叉韧带,大鼠

2018 届硕士学位论文6图 2 大鼠前交叉韧带切断术过程图2.2.4 空白对照组给予大鼠同其他组大鼠同样的抓取。处理后，各组大鼠群居、自由活动及进食、饮水。2.3 观察指标每天记录各组大鼠的一般状态，在实验开始的第 2、4、6、8 周的最后一天，分四批处理各组对应时间窗口的大鼠。进行行为学观察，对各组大鼠按改良版 LequesneMG 法[13]（见附录表 1 所示）进行评分；用 WAGNER 压痛仪测大鼠痛阈；取大鼠右后肢进行影像学观察；获取大鼠膝关节软骨，对膝关节软骨进行大体观察评分，HE染色切片并进行病理观察。2.3.1 一般情况观察及膝关节软骨大体观察评分仔细观察并记录大鼠的精神状态、姿势、皮毛色泽、活动度、饮水、大便等全身情况。在处死大鼠时，剥离大鼠右膝关节外肌肉层，切断膝关节所有韧带，打开关节腔，充分暴露股骨髁和胫骨平台，观察关节面软骨颜色、质感、形状和光滑程度。按照以下评分标准对大鼠右膝关节软骨进行大体观察评分[14]：软骨表面光滑、透明-0分；软骨表面光滑，而有瑕疵-1 分；软骨表面光滑，为乳白色不透明状-2 分；软骨表面不光滑

【参考文献】