纳米抗体合成库的构建及其初步应用
发布时间：2020-07-05 12:16
【摘要】：背景为了得到高亲和力以及高特异性的抗体,抗体的制备已经经历了漫长的发展史,现在抗体的制备主要有杂交瘤技术以及基因工程技术。基因工程技术中利用scFv文库来筛选获得单链抗体是最为常见的抗体筛选方法,这种抗体具有特异性高等优点,但是此种方法得到的抗体由于其尺寸以及亲和力等方面的限制,常常表现为稳定性较差。研究发现,在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体,该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区,但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘,甚至聚集成块。更重要的是这种抗体具有与双链抗体一样的结构稳定性以及与抗原的结合活性,是目前已知的可结合目标抗原的最小单位,称之为纳米抗体(Nbs)。从骆驼科中提取得到的纳米抗体由于其更小的尺寸等生化特性,稳定性好,因此比常规抗体平台更具有优势。纳米抗体已证明具有作为治疗分子和临床诊断工具的巨大价值。获得Nbs的常规程序是用抗原免疫骆驼,但当抗原具有高毒性,致病性或非免疫原性时,不能免疫骆驼,因此对抗原有一定的限制。合成纳米抗体库对于待筛选的抗原没有限制,使用起来更为便利。常规单克隆抗体的互补决定区(CDR)有六个,然而有研究发现,来源于骆驼科的纳米抗体由于具有自然界中最小的抗体分子量,因此它的互补决定区只有三个,但是CDR的减少并不会影响纳米抗体的抗体功能,其中纳米抗体的CDR3具有最大的多样性,对于纳米抗体的功能最为重要。噬菌体抗体库技术是抗体基因文库技术和噬菌体表面展示技术相结合形成的一项新技术与方法,在生物科学领域极具潜力。噬菌体抗体即在噬菌体表面表达有抗体分子的单链噬菌体,这种表面表达是通过抗体与单链噬菌体外壳蛋白(PⅢ或PⅧ)形成融合蛋白而完成的,这样一来噬菌体DNA中有抗体基因的存在,同时在其表面又有抗体分子的表达,就可以方便地利用抗原—抗体特异性结合的原理,通过多轮的抗原吸附-洗脱-扩增,而筛选出所需要的抗体。在本研究中,选取骆驼VHH框架作为支架,并随机化其中CDR3的氨基酸序列,构建合成了具有多样性的纳米抗体合成库,将Taq DNA聚合酶以及免疫球蛋白抗体(IgG)作为筛选抗原,使用噬菌体展示技术,最终从纳米抗体合成库中筛选得到两种抗原的亲和性抗体。目的构建纳米抗体合成库,在纳米抗体合成库的平台上,利用噬菌体展示技术筛选Taq DNA聚合酶以及抗免疫球蛋白的高亲和性抗体。方法1.基于骆驼保守单结构域抗体片段(VHH)框架,通过合成寡核苷酸的随机化将多样性引入互补决定区3(CDR3),构建了大型且多样化的纳米抗体合成文库。2.原核表达并纯化Taq DNA聚合酶,并检测其酶活性。3.利用噬菌体展示技术,从该文库中筛选Taq DNA聚合酶以及抗免疫球蛋白特异性的亲和性抗体。结果1.成功构建纳米抗体合成库,库容为10~8以上。2.成功构建并原核表达纯化出具有酶活性的Taq DNA聚合酶,能够实现在PCR反应中的应用,成功催化PCR反应。3.成功筛选到Taq DNA聚合酶以及抗免疫球蛋白的亲和性抗体。结论本实验中构建的纳米抗体合成库多样性丰富,并且具有应用价值,为后续的其他抗体的筛选提供了良好的平台。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392-33
【图文】：
图 2 1：VHH 抗体片段的合成片段和引物交由金唯智公司合成：：5′-CAA GTT CAA TTG GTT GAA TCT GGT GGT GGT TCTT TCT TTG AGA TTG TCT TGT ACT GCT TCT GGT GGT TCT ACT TTT TCT TTG GGT TGG TTT AGA CAA GCT CCAA GCT GTT GCT GCT ATT GCT TCT ATG GGT GGT TTG ACT GTT AAA GGT AGA TTT ACT ATT TCT AGA GAT AAT GCTT TTG CAA ATG AAT AAT TTG AAA CCA GAA GAT ACT GC GCT-3′GAAT GGCCCAGCCGGCC CAA GTT CAA TTG GTT GAA-3′GC AGC ACA ATA ATA AAT -3′AAAT GGCCCCCGAGGCC GA AGA AGA AAC AGT AAC TTGA MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN AGC AGC ACA ATA ATA AAT A-3′
图 3-1. PCR 产物电泳结果1-R1 不对称 PCR（321bp ）2. R2 DNA（ 1203. F1-R1 与 R2 重叠延伸 PCR（422bp）切之后，进行胶回收，取 5ul 进行 2％琼脂片段，条带单一并且位置正确，如图 3-2
本文编号：2742591
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392-33
【图文】：
图 2 1：VHH 抗体片段的合成片段和引物交由金唯智公司合成：：5′-CAA GTT CAA TTG GTT GAA TCT GGT GGT GGT TCTT TCT TTG AGA TTG TCT TGT ACT GCT TCT GGT GGT TCT ACT TTT TCT TTG GGT TGG TTT AGA CAA GCT CCAA GCT GTT GCT GCT ATT GCT TCT ATG GGT GGT TTG ACT GTT AAA GGT AGA TTT ACT ATT TCT AGA GAT AAT GCTT TTG CAA ATG AAT AAT TTG AAA CCA GAA GAT ACT GC GCT-3′GAAT GGCCCAGCCGGCC CAA GTT CAA TTG GTT GAA-3′GC AGC ACA ATA ATA AAT -3′AAAT GGCCCCCGAGGCC GA AGA AGA AAC AGT AAC TTGA MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN AGC AGC ACA ATA ATA AAT A-3′
图 3-1. PCR 产物电泳结果1-R1 不对称 PCR（321bp ）2. R2 DNA（ 1203. F1-R1 与 R2 重叠延伸 PCR（422bp）切之后，进行胶回收，取 5ul 进行 2％琼脂片段，条带单一并且位置正确，如图 3-2
【参考文献】
相关硕士学位论文 前2条
1 唐笑;耐热DNA聚合酶的定点诱变及应用于热启动PCR的纳米抗体的淘选[D];南昌大学;2015年
2 郭佳;Taq DNA聚合酶的结构修饰与表征[D];厦门大学;2014年
本文编号：2742591
本文链接：https://www.wllwen.com/xiyixuelunwen/2742591.html
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