人多能干细胞来源的红细胞体外3D培养条件的建立
发布时间：2020-07-05 19:57
【摘要】：目的:我们将人多能干细胞(hESCs)与小鼠主动脉-性腺-中肾区基质细胞(AGM-S3)共培养获得造血干/祖细胞,利用微球、胶原蛋白、透明质酸、多肽、纤维蛋白等构建的三维(以下简写为3D)材料在体外模拟造血微环境,定向诱导体外获得的造血干/祖细胞向成熟红细胞分化,并通过MGG染色、流式细胞术、免疫染色、PCR等手段分析诱导后收获的细胞,建立体外运用3D手段培养红系细胞的方法。方法:一、材料选择:选取魔芋葡聚糖微球、胶原微球、甲基纤维素、透明质酸、胶原蛋白、多肽、纤维蛋白等构建3D材料,进行红细胞体外定向诱导分化实验,筛选出本实验室条件下最佳的红细胞体外3D培养条件。二、细胞培养:本实验所用的胚胎干细胞系为H1细胞系。我们将H1与AGM-S3基质细胞共培养14天后收集细胞并进行CD34+磁珠分选实验,随后在无血清培养基SF-HSC[SFEM-2,SCF(50 ng/ml),FLT-3(50 ng/ml),TPO(50 ng/ml)]中扩增3-5天,此时CD34+CD45+细胞数达到其峰值。随后将细胞接种于不同3D材料与普通液体培养皿中,在无血清红系定向诱导7因子培养基[SFEM-2,VEGF(20ng/ml),SCF(100 ng/ml),IL-3(5 ng/ml),IL-6(50 ng/ml),FLT-3(5 ng/ml),TPO(50 ng/ml),EPO(4IU/mL);缩写为 SF-RBC-7FCs]中培养5天,继而更换为3因子培养基[SFEM-2,SCF(100 ng/ml),IL-3(5ng/ml),EPO(4IU/mL);缩写为SF-RBC-3FCs]继续培养9天。于红系定向分化后第7或14天后收集细胞,并进行细胞数量检测、MGG染色、流式分析、免疫染色及相关基因表达情况检测,比较不同培养条件下获得的红细胞的差异,确定本实验室内红细胞分化的最佳3D培养条件。结果:我们在hESCs与AGM-S3基质细胞共培养14天后收集细胞,在SF-HSC培养基中扩增3-5天后将收获的细胞接种于不同3D材料与普通液体培养皿中,在无血清红系定向诱导培养基下培养第7或14天后收集细胞,并进行细胞数量检测、流式分析等,比较不同培养条件下获得红系细胞的差异。结果表明,对于红细胞的扩增,液体培养优于两种微球所建立的3D培养体系;在水凝胶及支架培养体系中,以胶原蛋白为基础构建的支架3D培养体系要优于其他物质构建的水凝胶或支架3D材料。结论:1.以胶原微球、魔芋葡聚糖微球建立的3D培养方法不利于红系细胞生长,红系定向诱导14天后细胞数量及红细胞成熟度皆较液体培养低。2.胶原支架对红细胞的扩增能力明显优于液体培养及其他材料构建的水凝胶或支架3D培养体系,且胶原支架中获得的红细胞在成熟度上与液体培养无显著性差异。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：
造血千／祖细胞，经过或无需ＣＤ３４＋细胞磁珠分选实验，随后在ＳＦ－ＨＳＣ［ＳＦＥＭ－２，逡逑ＳＣＦ邋（５０邋ｎｇ／ｍｌ），ＦＬＴ－３邋（５０邋ｎｇ／ｍｌ）邋，邋ＴＰ０邋（５０邋ｎｇ／ｍｌ）］中对邋ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋逡逑细胞群扩增３－５天，此时⑶３４＋ＣＤ４５＋细胞群比例显著升高（见图１Ａ），通过逡逑比较培养前与培养后未分选细胞及分选细胞获得的总细胞数量和ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋逡逑细胞数量，我们发现未分选细胞扩增后总细胞数量略降低，但⑶３４＋ＣＤ４５＋细逡逑胞数量增多，扩增倍率为２．邋７１，系未分选细胞中含有较多ＡＧＭ细胞及不参与逡逑造血的其他细胞，这些细胞在培养过程中会死亡，但未分选细胞中的一些基质逡逑细胞有支持造血干／祖细胞扩X椀淖饔茫虼刷牵常矗茫模矗担赴吭龆唷７盅″义虾笙赴樱疲龋樱门嘌┰龊螅芟赴考埃茫模常矗茫模矗担赴烤黾樱义希咤蜗啾扔谂嘌埃茫模常矗茫模矗担赴康睦┰霰堵饰保澹梗怠Ｋ淙辉冢樱疲龋樱门嘌义虾螅盅『笙赴校茫模常矗茫模矗担赴康睦┰霰堵事缘陀谖捶盅∠赴皱义涎『笙赴校茫模常矗茫模矗担赴壤细咔易苁坑庞谖捶盅∠赴
本文编号：2743055
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：
造血千／祖细胞，经过或无需ＣＤ３４＋细胞磁珠分选实验，随后在ＳＦ－ＨＳＣ［ＳＦＥＭ－２，逡逑ＳＣＦ邋（５０邋ｎｇ／ｍｌ），ＦＬＴ－３邋（５０邋ｎｇ／ｍｌ）邋，邋ＴＰ０邋（５０邋ｎｇ／ｍｌ）］中对邋ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋逡逑细胞群扩增３－５天，此时⑶３４＋ＣＤ４５＋细胞群比例显著升高（见图１Ａ），通过逡逑比较培养前与培养后未分选细胞及分选细胞获得的总细胞数量和ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋逡逑细胞数量，我们发现未分选细胞扩增后总细胞数量略降低，但⑶３４＋ＣＤ４５＋细逡逑胞数量增多，扩增倍率为２．邋７１，系未分选细胞中含有较多ＡＧＭ细胞及不参与逡逑造血的其他细胞，这些细胞在培养过程中会死亡，但未分选细胞中的一些基质逡逑细胞有支持造血干／祖细胞扩X椀淖饔茫虼刷牵常矗茫模矗担赴吭龆唷７盅″义虾笙赴樱疲龋樱门嘌┰龊螅芟赴考埃茫模常矗茫模矗担赴烤黾樱义希咤蜗啾扔谂嘌埃茫模常矗茫模矗担赴康睦┰霰堵饰保澹梗怠Ｋ淙辉冢樱疲龋樱门嘌义虾螅盅『笙赴校茫模常矗茫模矗担赴康睦┰霰堵事缘陀谖捶盅∠赴皱义涎『笙赴校茫模常矗茫模矗担赴壤细咔易苁坑庞谖捶盅∠赴
本文编号：2743055
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