大麻素Ⅰ型受体单克隆抗体的制备及鉴定

发布时间：2020-07-07 13:01

【摘要】：大麻素Ⅰ型受体(cannabinoid type Ⅰ receptor, CB1R)是大麻素受体的一种,随着它的发现与克隆,越来越多的证据表明CBIR在内源性大麻素系统的各种生理作用中扮演了重要的角色。CBIR受体主要存在于神经组织中,在中枢神经系统(central nervous system, CNS)及外周神经系统的神经元、星型胶质细胞中都有表达,并且可以通过神经调节和激素调节等方式参与哺乳动物多种生理活动的调控。在内源性大麻素系统(Endogenous cannabinoid system, ECS)的各种生理作用中CBIR受体发挥着重要的作用。内源性大麻素系统紊乱造成非常严重的的危害,CBIR受体拮抗剂能够调节ECS的过度活化状态从而使其重建平衡减少危害。使用CBIR受体拮抗剂阻断CBIR受体拮抗剂可以减少食物摄入和脂肪堆积,同时还可以氧化游离脂肪酸,减少脂肪细胞分泌的不良因子,提高脂联素的水平,对于促进脂肪代谢和糖类代谢是非常有益的；此外CBIR受体拮抗剂还可以通过降低体重、减小腰围并改善各种代谢危险因素来达到降低心血管疾病危险的效果；分布于中枢神经系统和外周神经系统中的CBIR受体,在中枢神经系统和外周组织中对于缓解和预防疼痛也具有一定的作用,相关研究表明CBIR受体拮抗剂通过调节神经递质的释放,在疼痛信号转导的过程中发挥着极其重要的作用；在成瘾性方面,激活CBIR受体可以调节多种神经递质的释放,如多巴胺(DA)、Υ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu),这些物质与药物渴求、复发等过程皆有一定的相关性,分泌DA的中脑腹侧被盖区(VTA)及其主要投射区伏隔核在成瘾药物的刺激效应中发挥重要作用。相关实验表明在大鼠VTA内注射吗啡或伏隔核内注射苯丙胺可恢复其对海洛因或可卡因的需求。中枢神经系统GABA中间神经元的轴突末梢也含有大量CBIR受体,激动这些受体可以抑制GABA的释放,而GABA对DA投射神经元能发挥抑制作用,也就是说,在VTA水平上激动CBIR受体可以促进DA的释放。CBIR受体拮抗剂不仅能够抑制成瘾行为,降低对成瘾物质的依赖性还可以防止成瘾行为的复发。关于大麻素对药物需求的调节作用机制还不是非常清楚,目前的研究认为CBIR受体高度表达的脑区在复吸行为及条件反射过程中具有重要作用,这些脑区包括前额叶皮质、杏仁核、伏隔核、纹状体和海马。更为重要的是,最近关于人脑成像的研究显示,药物成瘾时的暗示诱发性渴求也具有类似的坏路。大麻素受体激动剂很有可能是通过增强中间神经递质DA的释放而促进对海洛因或可卡因的渴求的。由此可见,CBIR受体的进一步深入研究具有明显的意义,而国内关于其单克隆抗体的制备以及使用的报告还比较少,大部分为CBIR受体的多克隆抗体,那么成功制备出CBIR受体的单克隆抗体就是非常有必要的。本实验通过用多种软件预测,设计出了三条符合要求的CBIR氨基酸序列,然后通过马来酰亚胺基类活波酯法(MBS)将合成肽链与钥孔戚蓝蛋白(KLH)交联制成供免疫用的免疫原,之后分别免疫Balb/c雌性小鼠,第二次免疫后第九天取小鼠尾部血清分别测定免疫小鼠的尾血效价和抑制,根据测定结果选取效价高、抑制反应好的小鼠脾细胞作为融合细胞供体与骨髓瘤细胞SP2/0融合。融合后的细胞及时筛选、克隆,最终得到五株具有稳定分泌CBIR抗体能力的单克隆细胞。对得到的细胞株进行抗体效价、亲和力、抗体的类与亚型的鉴定,发现所得抗体的亚型为IgGl和IgG2b,轻链为K链,并且用纯化的腹水进行免疫组织化学和蛋白印迹的进一步检测,结果发现,制备的抗体效价高、亲和力好,并且可以用于免疫组化和蛋白印迹的研究。
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.1

【参考文献】