REGγ选择性介导降解氧化损伤HCV Core蛋白和p21及其机制
本文关键词：REGγ选择性介导降解氧化损伤HCV Core蛋白和p21及其机制，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：当细胞受到体外或者体内的氧化物质刺激时,会产生一系列变化,并生成活性氧(ROS)。活性氧是机体正常代谢的副产物,当其产生过量时便会对细胞造成损伤,包括损伤蛋白质、核酸、细胞膜等。一定程度的氧化损伤累积可以诱发相关疾病,如：动脉粥样硬化、肺纤维化、癌症、神经退行性疾病和衰老等等。研究表明,蛋白质是细胞氧化损伤最直接的作用对象,它与氧化自由基作用的几率大约是核酸的20倍。因此细胞内的抗氧化机制,很大程度上是发生在蛋白水平的。细胞内主要的抗氧化损伤机制应该是从清除过量的氧化损伤蛋白质着手。而据文献报道,20S蛋白酶体在降解氧化损伤蛋白质过程中起到了十分重要的作用。种11S蛋白酶体调节因子(REGy/PA28y)被报导参与调节20S蛋白酶体以一种非泛素和ATP依赖的方式降解蛋白质。我们的研究发现,一定浓度的H2O2处理HeLa细胞时,p21的蛋白质水平会迅速降低,而其mRNA水平却基本没有变化。而在稳定敲除REGy的HeLa细胞系中,氧化处理之后,p21的蛋白水平几乎没有变化。用不同浓度及不同种类的氧化剂处理也可以得到类似的结果,这说明REGy在氧化的p21蛋白质降解过程中起着十分重要的作用。因此,本文对REGy这种介导氧化蛋白降解的作用进行了进一步的研究和探索,通过对REGy介导降解的另一种目的蛋白——丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)进行氧化处理研究,也发现了同样的趋势。本文构建了HCV core的表达载体质粒,转入稳定敲除REGy以及不敲除(对照组)的HeLa细胞系中表达,经过氧化处理后,发现其降解趋势和p21一致。此外,在一组REGy无功能和正常功能的细胞系中,REGy正常功能的细胞中HCV core经氧化应激后也表现出了REGy依赖降解的现象,而氧化应激对REGy无功能细胞中HCV core的表达几乎无影响。这些现象说明,REGγ在氧化损伤蛋白的清除过程中十分重要。本文通过体外降解、免疫共沉淀和胰蛋白酶样活性检测实验还证明：氧化应激在一定程度上增强20S蛋白酶体的胰蛋白酶样活性,并加强了REGγ与20S蛋白酶体的相互结合。另一方面,通过对细胞衰老凋亡标志蛋白的表达检测和细胞形态观察实验,也证实了氧化蛋白p21和HCV core的降解现象与细胞氧化引起的衰老和凋亡没有直接关系。这些结果以新视角补充了REGy对氧化损伤蛋白的调控机制。尽管我们对于氧化蛋白的清除机制并不十分清楚,还需要进一步的实验研究。但是,本文的研究方式和结果为氧化蛋白的降解提供了一条新的通路,也为氧化相关疾病的研究提供了理论依据。
【关键词】：REGγ 蛋白酶体 p21 HCV core 氧化应激
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3411
【目录】：
- 摘要6-8
- Abstract8-12
- 1、综述12-25
- 1.1 REG_γ的发现与研究12-15
- 1.1.1 REG_γ的发现及其家族成员12
- 1.1.2 REG_γ及其家族的结构特性12-14
- 1.1.3 REG_γ及其家族的生物学活性14
- 1.1.4 REG_γ及其家族的功能14-15
- 1.2 蛋白酶体降解系统研究15-18
- 1.2.1 蛋白酶体结构分析15-16
- 1.2.2 蛋白酶体功能16-18
- 1.3 氧化损伤蛋白降解体系18-24
- 1.3.1 氧化应激反应18-19
- 1.3.2 氧化损伤引起的疾病19-20
- 1.3.3 氧化损伤蛋白降解20-24
- 1.4 研究目的与意义24-25
- 2. 材料与方法25-44
- 2.1 实验材料25-28
- 2.1.1 实验用细胞25
- 2.1.2 实验用试剂和材料25-27
- 2.1.3 设备仪器27-28
- 2.2 实验方法28-44
- 2.2.1 细胞培养过程(复苏、传代、冻存)28-29
- 2.2.2 蛋白免疫印迹(Western Blot)29-32
- 2.2.3 质粒构建32-37
- 2.2.4 病毒包装37
- 2.2.5 免疫共沉淀(co-IP)37-38
- 2.2.6 提取、鉴定基因组38-39
- 2.2.7 RNA提取(细胞中提取)39
- 2.2.8 反转39-40
- 2.2.9 QPCR(荧光定量PCR)40-41
- 2.2.10 半定量PCR41-42
- 2.2.11 体外降解实验42
- 2.2.12 蛋白酶体Trypsin-like活性检测42-44
- 3. 实验结果与分析44-67
- 3.1 氧化应激下REG_γ对p21依赖20S蛋白酶体降解的调控44-50
- 3.1.1 氧化处理下p21蛋白水平和mRNA水平的变化44-45
- 3.1.2 氧化处理下的其他细胞中p21的蛋白水平变化45-47
- 3.1.3 抗氧化剂对p21氧化降解的调节作用47-49
- 3.1.4 体外翻译表达的p21在氧化应激下的降解情况49-50
- 3.2 氧化应激下REG_γ对HCV core蛋白依赖20S蛋白酶体降解的调控50-59
- 3.2.1 HCV core蛋白表达载体的质粒构建和表达50-54
- 3.2.2 HCV core在氧化应激下蛋白的变化54-57
- 3.2.3 不同的氧化剂处理下HCV core的蛋白水平变化57-59
- 3.3 关于氧化损伤蛋白依赖REG_γ调控被降解的机制59-63
- 3.3.1 氧化应激促进REG_γ对20S蛋白酶体胰蛋白酶样(Trypsin-Like)活性的调控增强60-61
- 3.3.2 氧化应激会促进REG_γ和20S蛋白酶体的结合61-63
- 3.4 评估氧化对细胞的毒性效应63-67
- 3.4.1 氧化应激对细胞凋亡的影响63-65
- 3.4.2 氧化应激对细胞形态的影响65-67
- 4. 讨论与展望67-71
- 附录71-76
- 参考文献76-87
- 致谢87
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