血管新生中内皮细胞表型的基因表达谱分析

发布时间：2017-03-31 02:19

  本文关键词：血管新生中内皮细胞表型的基因表达谱分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景: 血管分布广泛，为机体提供氧气和营养，运走代谢废物；病理情况下，也可以促进肿瘤的发生发展。目前研究最为广泛的肿瘤血管形成途径为血管新生（Angiogenesis）。在此过程中，内皮细胞（endothelial cell, EC）形成三种表型：1.迁移表型，称顶端细胞（tip cell）；2.增殖表型，称柄细胞（stalk cell）；3.静息表型，称方阵细胞（phalanx cell）。这三种表型EC对于血管新生的发生发展至关重要。 方法： 采用高密度接种和血清饥饿法制备人脐静脉内皮细胞（human umbilical veinendothelial cell，HUVEC）系的静息表型，低密度接种和血清培养法制备HUVEC系增殖表型，Boyden小室法制备HUVEC系迁移表型；应用EdU法和流式细胞术检测HUVEC系的增殖能力，苏木精染色法检测HUVEC系的迁移能力，胰酶消化法收集迁移表型HUVEC系；利用基因芯片分析法在全基因组范围内筛选不同表型差异基因，并通过实时定量PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT PCR)验证。 结果： 1.体外获取HUVEC系静息表型，应用EdU法检测阳性率约5%，流式细胞术检测HUVEC系细胞周期，处于G1期细胞多于90%，S期低于10%，与EdU法检测结果基本一致。 2.体外获取HUVEC系增殖表型，，应用EdU法检测阳性率近80%，流式细胞术检测90%HUVEC系处于S期，与EdU法检测结果相似。 3. Boyden小室提供趋化浓度梯度，制备HUVEC系迁移表型。苏木精染色观察到HUVEC系迁移进入下室；对迁移细胞采用胰酶消化法收集，获取HUVEC系迁移表型，随着迁移时间的延长，收获细胞数量逐渐增加；EdU法检测阳性率约15%，流式细胞术检测S期比例也约为15%。 4.基因芯片分析增殖表型中差异表达基因。根据基因的生物过程分类，与静息表型EC相比，上调基因主要参与细胞周期，细胞核分裂和有丝分裂等生物过程；下调基因主要参与转录调控，RNA代谢和信号通路调节等生物过程；另外，差异基因主要参与DNA复制，细胞周期和嘧啶的代谢等信号通路。 5.基因芯片分析FBS诱导的迁移表型中差异表达基因。根据基因的生物过程分类，与静息表型EC相比，上调基因主要参与细胞死亡，磷酸盐代谢和血管新生等生物过程；下调基因主要参与转录调节，RNA代谢和GTP酶活性的调节等生物过程。 6.基因芯片分析VEGF诱导的迁移表型中差异表达基因。根据基因的生物过程分类，与静息表型EC相比，上调基因主要参与固醇的生物合成和代谢，脂质合成等生物过程；下调基因主要参与转录调控和胚胎发育的前后胚轴图式形成等生物过程；另外，差异基因主要参与固醇和萜类化合物的生物合成等信号通路。 7.对HUVEC系三种表型中10个差异表达基因进行qRT-PCR验证，结果与芯片结果相近。 结论： 1.采用不同接种密度和培养条件的体外制备方式成功获取HUVEC系的静息、增殖、迁移表型。 2.基因芯片筛选出三种表型的差异基因，生物信息学分析证实体外获取方法可行，并为进一步探究不同表型中的调节机制提供了数据资源。 3.不同诱导因子获取的迁移表型差异基因为研究单因素和多因素的迁移诱导方式提供了潜在的研究方向。
【关键词】：血管新生 内皮细胞 表型 基因表达
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文缩略词表8-11
• 第1章 文献综述11-20
• 第2章 实验研究20-51
• 第1节 实验材料及实验方法20-27
• 1.1 实验材料和仪器20-21
• 1.1.1 样本来源20
• 1.1.2 主要仪器及耗材20
• 1.1.3 主要试剂20-21
• 1.2 实验方法21-27
• 1.2.1 HUVEC 系的培养21
• 1.2.2 静息表型 HUVEC 系制备21-22
• 1.2.3 增殖表型 HUVEC 系制备22
• 1.2.4 迁移表型 HUVEC 系制备22
• 1.2.5 EdU 法检测 HUVEC 系增殖22-24
• 1.2.6 PI 染色检测细胞周期24
• 1.2.7 RNA 提取以及 qRT-PCR 分析24-26
• 1.2.8 基因芯片分析26-27
• 1.2.9 统计学分析27
• 第2节 实验结果27-51
• 2.1 HUVEC 系形态学观察27
• 2.2 制备静息、增殖和迁移表型 HUVEC 系27-30
• 2.2.1 不同表型 EC 增殖能力的检测28
• 2.2.2 不同表型 EC 细胞周期的检测28-29
• 2.2.3 细胞迁移能力的检测29-30
• 2.3 基因芯片检测不同表型 HUVEC 系中差异表达基因30-46
• 2.3.1 芯片样本的制备30-31
• 2.3.2 差异表达基因的筛选31-32
• 2.3.3 差异表达基因的聚类分析32-33
• 2.3.4 差异表达基因的生物信息学分析33-45
• 2.3.5 qRT-PCR 验证分析结果45-46
• 2.4 讨论46-51
• 第3章 结论51-52
• 参考文献52-57
• 作者简介及攻读硕士期间的研究成果57-58
• 致谢58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ZHANG Ping;YAN XianChun;CHEN Yan;YANG ZiYan;HAN Hua;;Notch signaling in blood vessels: from morphogenesis to homeostasis[J];Science China(Life Sciences);2014年08期

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本文编号：278669