FGFR1通过调控骨细胞功能影响骨稳态的作用和机制研究

发布时间：2017-03-31 02:25

  本文关键词：FGFR1通过调控骨细胞功能影响骨稳态的作用和机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景:骨骼是人体最重要的力学支持器官,除对机体起支撑和保护作用外,骨骼在人体的代谢、内分泌调节及造血中发挥重要的作用。骨骼是机体矿物质代谢的重要参与者,通过控制钙磷等无机物的储存和释放,可调节人体矿物质的平衡。骨骼还能作为内分泌器官释放多种因子,如骨钙素(Osteocalcin,OCN)、成纤维细胞因子23(Fibroblast growth factor 23,FGF23)等,参与人体能量代谢、血糖、血磷平衡等重要生理过程。骨细胞是骨自身稳态维持及内环境稳定的重要因素,它能通过多种途径维持其附近内环境稳定,还能对力学信号进行感知和传导,并调控其周围骨基质矿化。还可通过其树突与骨表面的成骨细胞和破骨细胞建立联系,调节其分化,影响骨重建。此外,骨细胞还具有内分泌功能,调节矿物质代谢。FGFR1(Fibroblast growth factor receptor 1,成纤维细胞生长因子I型受体)是FGFRs家族的重要成员,在骨骼发育中发挥重要作用。其突变可引起多种骨骼遗传性疾病。FGFR1在骨膜、间充质细胞和各阶段成骨细胞中表达。FGFR1对成骨细胞不同时期作用有差别,在骨骼发育早期抑制其前体细胞增殖,促进向其分化,晚期抑制其矿化。骨细胞是成骨细胞的终末分化状态,亦可能受FGFR1调控。有研究表明FGFR1参与调控骨细胞功能。Wnt/β-catenin信号是调节骨细胞功能的关键环节。不仅能改变骨密度、调节骨细胞释放重要因子,还能调控其力学信号传导、保持细胞活性。FGF与Wnt信号间存在相互影响与串话。我们前期研究也发现FGFR2和FGFR3均可调节Wnt/β-catenin报道基因活性。因此,我们推测FGFR1也能通过Wnt/β-catenin信号通路调控骨细胞功能。研究目的:明确FGFR1对骨细胞的调控作用。从全新的角度认识FGFRs调控骨代谢及机体稳态的机制,也为从干预FGF/FGFR信号角度调控机体稳态提供新的思路。方法:1.获取、繁殖和鉴定FGFR1在骨细胞特异敲除的小鼠(Fgfr1DMP1-CKO,突变小鼠);2.骨细胞特异敲除FGFR1对骨发育的影响;2.1对胚胎15.5天胎鼠全骨架茜素红/阿尔辛蓝染色,对比野生和突变小鼠在胚胎期的骨发育情况;2.22月龄和6月龄小鼠身长、体重测量,比较其发育有无差异;2.3x线扫描对比观察两组小鼠体型和骨量;2.4microct扫描野生型和突变型小鼠股骨,对比观察骨小梁及骨皮质变化;2.5对小鼠胫骨切片vonkossa染色后观察骨骼矿化情况,并进行骨骼形态学计量;3.骨细胞特异敲除fgfr1对机体内环境稳态的影响;3.1检测两组小鼠2月和6月时血糖及血清钙磷水平;4.骨细胞特异敲除fgfr1对骨重建的影响;4.1对2月龄和6月龄小鼠骨组织切片、染色,观察其形态;4.2钙黄绿素双标实验对比观察两组小鼠骨形成速率;4.3甲苯胺蓝染色形态计量单位骨表面成骨细胞;4.4通过trap染色观察骨小梁表面的破骨细胞,并计量单位骨表面上的数量及相对表面积;5.骨细胞特异敲除fgfr1对骨细胞形态和功能的影响;5.1he染色观察骨细胞和骨陷窝形态;5.2扫描电镜观察骨细胞及骨陷窝形态变化;5.3提取股骨干总rna,对比两组间相关基因表达变化;5.4分离培养原代骨细胞,观察fgfr1敲除的骨细胞形态是否有变化;5.5提取原代骨细胞rna,对比观察相关基因表达变化;6.骨细胞凋亡的相关实验;6.1计数6月龄小鼠骨皮质骨细胞空陷窝比例;6.2透射电镜观察6月龄骨皮质骨细胞;6.3tunel法检测6月龄骨细胞凋亡情况;6.4提取股骨干总rna,检测凋亡相关基因表达;结果:1.骨细胞中特异敲除fgfr1不影响胚胎期骨发育;胚胎15.5天胎鼠全骨架染色发现,两组胎鼠体型无明显差异,骨骼发育亦无显著差别;2.骨细胞特异敲除fgfr1对成年小鼠发育无显著影响,骨量增多;2.1对2月龄和6月龄小鼠进行对比观察,发现野生小鼠和突变小鼠在这两个时相点的身长、体重均无明显差异;2.2x线扫描对比观察两组小鼠,发现体型无明显差别。突变小鼠骨量较野生小鼠增加;2.3microct扫描发现,突变小鼠bv/tv、conn-dens、tb.n和tb.th均显著增高,smi和tb.sp则明显减低。;2.4胫骨切片vonkossa染色形态学计量结果与上述一致,均提示突变小鼠骨量增加;3.骨细胞特异敲除fgfr1后,成年的野生和突变小鼠血糖及钙磷无显著变化;3.1骨细胞特异敲除fgfr1后,2月龄和6月龄突变小鼠血糖均有降低趋势,但两组间差异无统计学意义;3.2骨细胞特异敲除fgfr1后,野生小鼠和突变小鼠的血清钙磷水平在2月和6月时相点均无显著差异;4.骨细胞特异敲除fgfr1后,骨量增多,骨形成增快;4.1组织切片vonkossa染色观察发现突变小鼠骨小梁数量明显增加,形态无显著异常,未见明显矿化障碍;4.2骨组织切片双标检测发现,突变组小鼠骨形成速率、矿化沉积率以及矿化表面积均显著增加;4.3骨组织切片甲苯胺蓝染色形态学计量发现,突变小鼠单位骨表面成骨细胞数量显著增加;4.4骨组织切片trap染色形态学计量发现,突变小鼠单位骨表面破骨细胞数量及破骨细胞相对面积均显著减少;5.骨细胞特异敲除fgfr1影响骨细胞形态和功能,骨陷窝形态亦发生变化;5.1he染色切片发现6月龄突变小鼠骨皮质大量空陷窝;5.2扫描电镜观察发现6月龄突变小鼠大量骨细胞形态趋于椭圆或圆形;骨细胞陷窝形态随之改变,并且有皱缩;5.3提取股骨干组织总rna,检测相关基因表达,结果显示突变组骨细胞标志性基因fgf23、sost、dmp1表达均明显减少。与wnt信号相关的β-catenin、lef-1、dvl表达显著增高,axin2表达明显减少。opg/rankl比例与破骨细胞分化和功能密切相关,我们在实验中发现前者表达明显增高,后者表达明显减少,opg/rankl比例上调。5.4分离两组小鼠原代骨细胞,培养观察未见其形态有显著差异。5.5突变小鼠原代骨细胞标志性基因fgf23、sost表达明显减少,dmp1表达明显增加。与wnt信号相关的β-catenin、dvl表达明显增高,lef-1表达有增高趋势,无统计学差异。与破骨细胞分化和功能相关的OPG表达明显增高,RANKL表达明显减少。6.骨细胞特异敲除FGFR1引起骨细胞凋亡。6.1 6月龄胫骨石蜡切片HE染色见突变小鼠骨皮质空骨陷窝明显增多。6.2透射电镜观察发现6月龄突变小鼠存在大量凋亡特征骨细胞,表现为细胞皱缩、核凝集、凋亡小体。6.3 TUNEL免疫荧光染色法显示突变小鼠骨陷窝中凋亡阳性信号明显增加。6.4突变型骨细胞中与凋亡相关的基因Caspase3和Caspase8表达显著升高。结论:1.骨细胞缺失FGFR1对胚胎期小鼠无显著影响。2.骨细胞特异敲除FGFR1引起FGF23表达减少,并未影响血清钙磷水平。3.骨细胞特异敲除FGFR1使成年期突变小鼠骨量增加,骨形成增快。4.骨细胞特异敲除FGFR1促进成骨细胞分化,抑制破骨细胞分化和功能。5.骨细胞特异敲除FGFR1后SOST表达减少,上调WNT信号通路,引起骨量增加;此外,OPG/RANKL比例上调,负性调控破骨细胞分化和功能,抑制了骨骼重吸收,从而增加骨量。6.骨细胞特异敲除FGFR1会引起骨细胞凋亡。
【关键词】：FGFR1 骨细胞 基因敲除 发育 骨稳态
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R336
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 英文摘要7-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-18
• 1.1 骨细胞可调控骨稳态14-15
• 1.2 FGFR1 可能影响骨细胞功能15-16
• 1.3 Wnt/β-catenin信号可能参与FGFR1 对骨细胞的调控16-18
• 第二章 实验材料和方法18-33
• 2.1 实验材料18-21
• 2.2 实验方法21-33
• 第三章 结果33-52
• 3.1 Fgfr1DMP1-CKO小鼠的准备33-35
• 3.2 骨细胞特异敲除FGFR1 影响小鼠成年期骨量35-41
• 3.3 在骨细胞特异敲除FGFR1 后,单位骨小梁表面的成骨细胞和破骨细胞数量显著变化。41-43
• 3.4 骨细胞特异敲除FGFR1 后骨小梁骨形成速度增快。43-44
• 3.5 骨细胞敲除FGFR1 后影响骨细胞功能,可能与WNT信号有关。44-45
• 3.6 FGFR1 敲除后不影响体外培养的骨细胞形态,但对其功能有明显影响。45-49
• 3.7 骨细胞特异敲除FGFR1 引起骨细胞凋亡49-52
• 第四章 讨论52-56
• 4.1 骨细胞中特异敲除FGFR1 不影响血糖及钙磷水平53
• 4.2 骨细胞特异敲除FGFR1 后未影响胚胎期骨发育,成年期骨量增多53
• 4.3 骨细胞特异敲除FGFR1 后骨形成加快,无明显矿化障碍53-54
• 4.4 骨细胞敲除FGFR1 影响其形态和功能54
• 4.5 骨细胞敲除FGFR1 后通过上调WNT信号增强成骨作用,通过OPG- RANKL通路抑制破骨细胞分化与功能54-55
• 4.6 骨细胞缺失FGFR1 引起骨细胞凋亡55-56
• 全文结论56-57
• 参考文献57-61
• 文献综述 成纤维细胞生长因子I型受体在骨发育和骨稳态中的作用61-68
• 参考文献65-68
• 攻读学位期间发表的论文68-69
• 致谢69

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本文编号：278698