自噬相关因子MAP1S介导TLR通路调控及其机制研究

发布时间：2020-08-20 18:02

【摘要】：Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）是天然免疫中最重要的模式识别受体之一，它能够识别并结合一系列具有相同病原相关分子模式（PAMPs）的病原体和内源性的损伤相关分子模式（DAMPs），向细胞内传递信号，启动机体的免疫应答并激活炎症反应。Toll样受体的识别范围广泛，既包括细菌、病毒和寄生虫等病原体，还包含肿瘤抗原以及自身衰老和坏死细胞释放的分子。Toll样受体不仅表达于免疫细胞，也表达于肿瘤细胞。因此，Toll样受体与宿主的感染、炎症反应和肿瘤发生等多种疾病存在交互关联。但是截至目前为止，Toll样受体在肿瘤细胞中的作用机制仍然不是很清楚。感染和肿瘤发生过程中常伴随着Toll样受体信号激活的细胞吞噬和自噬现象。目前，在严重感染和肿瘤的治疗领域中，针对Toll样受体的靶向治疗引起了越来越多的关注。但是Toll样受体信号诱导细胞自噬和病原体吞噬的分子机制仍然不清楚，介导Toll样受体信号通路的细胞自噬相关因子以及调控网络仍亟待深入探讨。MAP1S是近年来新发现的自噬相关因子，在各种组织中广泛表达，并且对细胞自噬的发生和发展具有促进作用。截至目前，关于MAP1S介导Toll样受体信号通路调控及其机制的研究仍未见报道。本研究以MAP1S为研究对象，从Toll样受体信号促进巨噬细胞的吞噬功能和Toll样受体信号通过介导自噬抑制乳腺癌细胞的增殖与迁移两个层面，分析了Toll样受体信号促进细胞吞噬和自噬的分子机制，并探讨了MAP1S在Toll样受体信号串联细胞吞噬和自噬功能中的作用。细胞吞噬和自噬的过程中Toll样受体处于激活状态，并引发炎症反应，提示三者之间存在着必然的联系。本研究以MAP1S基因敲除鼠为研究模型，利用不同的Toll样受体激活剂刺激小鼠原代巨噬细胞，比较了野生型和MAP1S缺失的巨噬细胞分泌细胞因子的差异，发现MAP1S的缺失显著地下调了TLR2配体LTA诱导巨噬细胞分泌IL-6的含量。在检测TLR2信号调控的转录因子和转录激活因子活性实验中，发现MAP1S的缺失抑制了TLR2信号激活的转录因子NF-κB和转录激活因子p38的活性。在野生型巨噬细胞中，MAP1S的表达响应TLR2信号而显著性上调，并且表现出对LTA诱导的时间依赖性。此外，表达上调的MAP1S通过激活细胞自噬，反馈抑制Toll样受体信号持续活化所致的炎症反应。以上结果提示，MAP1S对巨噬细胞TLR2信号具有双向调控作用，具体地说，MAP1S参与早期TLR2信号诱导细胞因子的表达，而反馈性抑制晚期TLR2信号持续激活所致的过强炎症反应。研究中进一步发现，MAP1S的缺失降低了巨噬细胞部分TLRs的基础表达，从而影响了巨噬细胞的细菌吞噬功能，而且巨噬细胞的细菌杀伤能力同样由于MAP1S的缺失而显著下调。在肿瘤细胞的Toll样受体信号与细胞自噬发生的关系研究中，鉴于前期研究结果提示，TLR5配体flagellin对乳腺癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，因此，我们首先利用全细胞MALDI-TOF质谱确认了flagellin对乳腺癌细胞MCF-7活性的抑制作用，并证实了自噬相关因子MAP1S在多种乳腺癌细胞中的普遍表达。MTT细胞增殖实验和软琼脂单细胞克隆形成实验的结果表明，MAP1S沉默的MCF-7细胞不响应flagellin的抑制作用。经flagellin处理的MCF-7细胞发生G1期阻滞现象，细胞周期蛋白cyclinD1的表达显著下调，而周期依赖型激酶抑制因子p27的表达明显上调，但MAP1S沉默的MCF-7细胞的细胞周期没有发生任何改变。由此证实，MAP1S可通过TLR信号通路调控乳腺癌细胞的增殖，当TLR受到特异性配体激活后，可通过MAP1S介导细胞增殖的调控信号通路。考虑到MAP1S具有调控细胞骨架网络动态稳定的功能，本研究采用侵袭小室和细胞划痕修复实验，检测了MAP1S是否影响经flagellin处理的MCF-7细胞的侵袭和迁移能力。实验结果表明，flagellin能够极大程度地抑制MCF-7细胞的侵袭和迁移，但在MAP1S沉默的MCF-7细胞中，flagellin的抑癌作用受到了限制，提示MAP1S在flagellin抑制肿瘤细胞增殖和迁移的过程中起着关键作用。此外，本研究还发现，MAP1S在flagellin诱导MCF-7细胞表达细胞因子IL-8和TNF-α的过程中发挥重要的调控作用。MAP1S也会响应TLR5信号而表达上调，表达上调的MAP1S通过诱导细胞发生自噬反应，反馈性地抑制肿瘤细胞中TLR5信号持续激活的炎症反应。为了探讨MAP1S在巨噬细胞Toll样受体信号促进细胞吞噬和在乳腺癌细胞Toll样受体信号抑制肿瘤细胞增殖和迁移过程中的分子机制，本研究利用免疫印迹和免疫荧光实验，分别对巨噬细胞、MCF-7细胞和正常的人胚肾HEK293T细胞中Toll样受体信号诱导自噬标志分子LC3的LC3II/I蛋白比例以及LC3聚集体形成（自噬或吞噬功能增加的标志）进行了分析。结果表明，只有MAP1S表达响应的Toll样受体信号才能诱导细胞中的LC3聚集体的形成和LC3II/I比例的增加，提示在MCF-7细胞中flagellin/TLR5信号诱导了肿瘤细胞的自噬发生，在巨噬细胞中LTA或细菌/TLR2信号促进了细胞的吞噬功能。为获得MAP1S介导TLR信号通路活化的调控位点，本研究进一步分析了MAP1S与Toll样受体接头蛋白MyD88的相关性，发现MAP1S与MyD88具有相互作用，并且MAP1S可以通过响应Toll样受体信号将MyD88转运至LC3II结合的自噬体或吞噬体，促进自噬体/吞噬体的成熟。而响应性上调表达的MAP1S可以通过诱导细胞自噬的发生，选择性地降解MyD88，反馈抑制Toll样受体信号的持续活化。综上所述，本文通过研究自噬相关因子MAP1S对巨噬细胞和肿瘤细胞Toll样受体信号的调控，证实了MAP1S通过介导Toll样受体信号促进细胞吞噬和自噬的功能，这一发现是Toll样受体、细胞自噬与吞噬作用相关性的最新证据，也为研究Toll样受体信号促进细胞自噬和吞噬作用的深层机制提供了一条新的线索。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392.12
【图文】：

过程图,细胞吞噬,过程

图 1-1 细胞吞噬过程[92]Fig. 1-1 Phases of phagocytosis噬细胞的受体细胞的受体通过结合被吞噬粒子表面的配体启动吞噬的最初gulfment）。很多受体参与吞噬过程，Fcγ受体（FcγRs）在吞噬比较清晰，Fcγ受体通过自身磷酸化或由Src家族蛋白激酶磷酸胞内信号[7]。脂筏（lipid raft）起着偶联蛋白激酶和受体的作用相关的细胞吞噬中并不起主要作用[94]。抗原提呈细胞主要的吞够识别假丝酵母细胞表面表达的β-葡聚糖，但是假丝酵母的致体能够转换为丝状形态逃避Dectin-1的识别和吞噬细胞的吞噬[9受体如scavenger receptors (SR)在细胞吞噬中的作用尚不明确，SR敲除鼠来源的树突状细胞对大肠杆菌的内吞能力有所下降[97细胞对细菌的吞噬常伴随着由 TLR 信号激活的炎症反应，这一噬和 TLR 有着功能上的相互联系。Blander 和 Medzhitov[5, 6]发

自噬体,自噬,相关因子,过程

膜直至形成完整的自噬体（autophagosome）。自噬体和溶酶体（lysosome）合，发展成熟成为自噬溶酶体（autolysosome），内涵物在自噬溶酶体中降解图 1-2）。已有研究证明，自噬体形成初期的膜来源于线粒体、高尔基复合体和内质[121, 122]，但是自噬泡的膜延长过程中的膜来源及机制尚不清晰。介导膜泡运和融合作用的 SNAREs 或小 GTPase在自噬体形成过程中没有直接发挥作用。管定位于高尔基的 GTPase Rab33B 与 Atg16L 有直接相互作用，但是其相互用在自噬中的作用仍不清晰[123]。近期研究表明，Atg9 的自身多聚化能促进的融合。Atg9 是唯一被发现与自噬体形成有关的完整的膜蛋白。在酵母中，tg9 定位于自噬泡组装位点（PAS）及其周围结构[124]。Atg11，Atg23 和 Atg27于 Atg9 转运到 PAS 的过程至关重要[125-128]。因此，Atg9 可能作为运载膜的体通过动态的自身相互作用在自噬泡延长过程中起作用。当自噬开始时，哺动物 Atg9 与 LC3 结合，实现从反式高尔基网络（TGN）到后期内涵体endosome）的转运。Atg9 从反式高尔基网络（TGN）到后期内涵体的再分配程决定于 ULK1 和 Atg13[129, 130]。

模型图,泛素化,自噬,受体

第 1 章绪论和其他泛素化的载体，运输至自噬体完成自噬降解[137, 138]。哺乳动物蛋白 p62和酵母蛋白 Atg19的 C 端模序在结构和功能上的相似性产生了一个假说，即p62是 Atg19 在高等真核生物中的同源类似物，它们的作用是作为细胞自噬中的受体，选择性招募泛素化蛋白或泛素化细胞器至自噬体[139]。

【参考文献】