沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的研制与初步应用

发布时间：2017-03-31 18:06

  本文关键词：沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的研制与初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：沙门菌种类繁多,已知的血清型已有2600多种,严重影响人类健康和畜牧业的发展,对沙门菌的检测和诊断是防控沙门菌病的重要手段之一。沙门菌致病岛2(Salmonella pathogenicity island 2, SPI-2)的基因编码的Ⅲ型分泌系统(T3SS)促进沙门菌病。沙门菌在细胞内的复制发生在沙门菌膜性小泡(SCV)中,并且通过毒力岛2 T3SS转移大约30个效应蛋白到宿主膜性系统及细胞质中。由沙门菌毒力岛2编码的效应蛋白SpiC对于沙门菌在宿主吞噬性细胞内的存活起重要作用,它是在沙门菌中发现的第一个宿主转运干扰蛋白,能被SPI-2 T3SS导出细菌并进入宿主细胞胞质中,并与宿主细胞的蛋白互作,抑制吞噬体和溶酶体的融合。spiC基因在NCBI序列比对后发现,是在沙门菌中特有的,并且同源性在99%-100%。单克隆抗体技术作为现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构与功能研究方面以及免疫学诊断方面有着不可或缺的作用。因此,筛选具备沙门菌特异性阻断效果的单克隆抗体,研发竞争ELISA检测试剂(盒),为沙门菌的检测和沙门菌病的诊断提供快速、有效的技术手段势在必行。本研究以纯化的重组融合蛋白rHis-SpiC为免疫原,免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,以纯化的重组融合蛋白rGST-SpiC为检测原,经过间接ELISA检测和多次亚克隆,共获得7株能稳定分泌SpiC蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3G9、3B2、4D9、4F7、5F8、6H2、6B9。对所制备的7株单克隆抗体进行亚类测定,结果显示7株SpiC单克隆抗体其中5株为IgG1,2株为IgG2a;对7株单克隆抗体进行腹水效价测定,结果它们的腹水ELISA效价均很高,在1×105-1×107之间：单克隆抗体的特异性鉴定结果显示7株单抗均与SpiC蛋白发生反应,而与其他蛋白不发生反应。Western blotting鉴定结果显示,7株SpiC单克隆抗体均可与rGST-SpiC和rHis-SpiC发生特异性反应,出现目的条带大小一致的特异性条带,而与重组菌BL21 (pGEX-6p-1)和BL21 (DE3)(pET)无特异性反应。将沙门菌点在硝酸纤维素膜(NC膜)上,利用单抗的特异性建立Dot-ELISA方法,以检测沙门菌,结果显示,单抗仅能与沙门菌发生特异性反应,而不和非沙门菌发生特异性反应。用该方法共检测189株菌株,其中阳性为173株,阴性为16株,与stn检测结果一致。以纯化后的融合蛋白GST-SpiC作为包被抗原,并根据7株单抗的特性和腹水效价,挑选出单抗5F8作为竞争抗体建立了检测SpiC蛋白抗体的竞争ELISA方法。经过蛋白包被浓度、抗体稀释浓度、血清稀释度、最适封闭液、竞争时间等条件的优化,最终建立了灵敏度高、特异性好的竞争ELISA方法,并利用该方法对感染沙门菌的鸡血清进行检测。用该方法检测了鸡血清149份,结果显示,共检出121份阳性样品,检出率为81.21%,阴性样品28份,检出率为18.79%。玻板凝集试验共检出阳性样品数为70,阳性检出率为46.98%,阴性样品79,检出率为53.02%,本研究建立的竞争ELISA方法具有简单、快速、灵敏度高等特点,可以被广泛用于鸡血清中沙门菌抗体水平的检测。综上所述,本研究共成功制备了7株能稳定分泌沙门菌SpiC蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,7株单抗均可特异性识别原核表达系统表达的SpiC蛋白,具有较好的特异性和免疫反应性,为SpiC的相关基础研究提供了重要试剂,同时在沙门菌检测和沙门菌病的诊断研究以及各种新型疫苗和诊断试剂的研发方面具有重要应用价值。
【关键词】：沙门菌 SpiC蛋白 单克隆抗体 竞争ELISA
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4;R392
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-8
• 符号说明8-10
• 文献综述10-21
• 1 沙门菌的特点和危害10-11
• 2 沙门菌检测方法11-15
• 3 SpiC蛋白研究进展15-16
• 参考文献16-21
• 第一章 沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的研制和鉴定21-34
• 1 材料21-22
• 2 方法22-27
• 2.1 抗原SpiC蛋白的制备22-23
• 2.2 单克隆抗体的制备23-26
• 2.3 SpiC单克隆抗体的鉴定26-27
• 3 结果27-31
• 3.1 免疫原制备27
• 3.2 检测原制备27
• 3.3 杂交瘤细胞株的建立27-28
• 3.4 单抗亚类以及腹水效价鉴定结果28-29
• 3.5 腹水的纯化29-30
• 3.6 单抗与重组蛋白的特异性鉴定30
• 3.7 Western blotting分析30-31
• 4 讨论31-32
• 参考文献32-34
• 第二章 沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的初步应用34-48
• 1 材料34
• 2 方法34-37
• 2.1 单抗与沙门菌的特异性反应34-35
• 2.2 Dot-ELISA检测沙门菌35
• 2.3 检测沙门菌抗体的单抗竞争ELISA方法35-37
• 3 结果37-43
• 3.1 单抗Dot-ELISA的特异性37
• 3.2 Dot-ELISA检测沙门菌结果37-38
• 3.3 检测沙门菌抗体的单抗竞争ELISA方法38-43
• 4 讨论43-46
• 参考文献46-48
• 全文小结48-49
• 致谢49-50
• 攻读硕士期间发表的学术论文50-51

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