STAG2在红系发育过程中的功能研究

发布时间：2020-08-21 23:23

【摘要】：目的:红系发育是一个复杂的多阶段过程,历经早期祖细胞分化,终末分化以及网织红细胞的成熟,然而这一发育过程可能会受到诸多因素的影响,导致原有的正常发育过程发生异常。骨髓增生异常综合征(MDS)是一类与红系发育障碍密切相关的疾病,主要表现为红系、粒系和巨核细胞系中的一系或多系发育异常。研究发现在MDS患者中STAG2是高频突变的基因之一,表明STAG2的表达及功能异常可能在MDS发病和恶性演进中起着重要作用。为研究STAG2在红系发育中的功能作用,本课题基于shRNA干扰基因表达的方法,筛选出STAG2敲低的K562、HEL及CD34~+细胞,其中K562和HEL细胞可通过特殊的诱导方式向红系分化,而CD34~+造血干细胞同样可向红系分化并能到达细胞脱核阶段。通过敲低STAG2,检测其对红系发育进程的影响,有助于理解正常红系发育及MDS发病相关红系发育障碍的机理。方法:首先对STAG2及其家族进行生物信息学分析,包括进化关系、蛋白结构及基因信息等。其次构建STAG2的shRNA表达型载体,以得到STAG2敲低的K562、HEL以及CD34~+细胞。然后用氯化高铁血红素(Hemin)诱导STAG2敲低的K562和HEL细胞,使其向红系分化,自诱导后连续四天分别对细胞进行计数、联苯胺染色检测血红蛋白、Annexin V/PI双染色流式检测细胞凋亡和PI染色流式检测细胞周期。针对STAG2敲低的CD34~+细胞,在促红细胞生成素(EPO)诱导其向红系分化的培养体系中,第6天以IL-3R、GPA、CD34和CD36为细胞表面标志物,流式检测红系祖细胞BFU-E和CFU-E的分化。其后以GPA、band3和α4-integrin为细胞表面标志物,从第7天至第15天每隔一天检测细胞的终末分化。最后在第15天和第17天时,用syto16荧光染料检测细胞的脱核。结果:首先STAG2及其家族基因位于不同的染色体上,蛋白都含有STAG和SCD结构域,氨基酸序列较为相似,但从进化树的分析结果来看,它们在脊椎动物的演化中出现了分离。其次得到了STAG2敲低的K562、HEL和CD34~+细胞,并用qRT-PCR验证了敲低效率。诱导K562和HEL细胞向红系分化的结果显示,STAG2敲低组的细胞生长变慢,分化延迟,细胞凋亡增加,而细胞周期无显著性变化。在CD34~+细胞的红系分化培养体系中,第6天STAG2敲低组的BFU-E增多,CFU-E减少,GPA表达降低,第7天与第9天STAG2敲低组的GPA表达水平依旧低于对照组,但在第11天至第15天的检测中,对照组与STAG2敲低组的GPA、band 3和α4-integrin基本趋于一致,表明STAG2敲低主要延迟红系祖细胞的分化。最后在细胞脱核的检测中,STAG2敲低组的syto16阴性细胞低于对照组,表明STAG2敲低导致细胞脱核率的降低。结论:1.STAG2及其同家族蛋白结构相似,都含有STAG和SCD结构域,氨基酸序列相似度较高,但它们在脊椎动物的演化中出现了分离。2.在STAG2敲低的红系发育过程中,细胞的增殖减慢,凋亡增加,红系祖细胞分化延迟以及细胞脱核率减少。因此,在红系发育过程中,STAG2参与细胞的增殖、分化、凋亡及脱核等多种重要生物学事件。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：

红细胞膜结构示意图（摘自文献[4]）

红细胞凋亡的信号通路（摘自文献[34]）

造血谱系分化图（摘自文献[43]）

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 姜立,马文丽;人红白血病K562细胞与红系分化的调控[J];第一军医大学学报;2001年06期

本文编号：2799975