京尼平苷对帕金森病模型神经保护作用的研究

发布时间：2020-08-22 00:57

【摘要】：帕金森病(PD,Parkinson disease's)是老年人黑质致密部多巴胺能神经元中枢性进行性神经退化性疾病,其病理生理机制与黑质致密部多种神经系统的改变有关。帕金森病临床症状可出现静止性震颤、肌强直等,主要病理特征是黑质含色素的多巴胺能神经元丢失,残存的神经细胞质中出现嗜酸性包涵体路易小体(Lewy),α-突触核蛋白(α-synuclein)是路易小体的主要组成部分,它是一种幼稚的蛋白泛素化包括中枢神经核周体及路易蛋白,与中枢神经系统中蛋白合体相似,αa-synuclein的三倍基因体SNCA在早期帕金森病合并痴呆中被发现。帕金森病真正的病因尚不明确,但很多研究显示凋亡引起中枢神经神经元退化是其中一个重要的机制,治疗主要是通过美多巴、多巴胺受体激动剂、胆碱酯酶抑制剂等改善临床症状,并不能阻止多巴胺能神经元细胞凋亡或提高受损的多巴胺能神经元细胞的功能。此外,长期应用也会导致一系列不良反应。因此,当务之急是能够研究出一种能够推迟、干预、甚至是阻止多巴胺神经元细胞退化,治疗帕金森的新药。京尼平苷(Geniposide,GP)是一种重要的环烯醚萜类化合物,取自中药栀子,在中国传统药书中出现,用来治疗肝癌、感染、外伤、脑部疾病等。有报道显示:京尼平苷在MPTP诱导的帕金森大鼠模型中具有中枢神经脑保护作用。它的脑保护作用在其他疾病中也有报道,比如阿尔茨海默病,可能与通过RAGE信号通路有关。microRNAs(miRNAs)越来越受到认可与重视,它能调控基因表达、调控基因事件的发生,选择相应靶点并参与许多病理生理反应过程,机制可能与参与神经细胞凋亡有关。miRNA-21(miR-21)可以通过靶向细胞发挥抗凋亡作用并通过诱导FAS配体来保护神经元免于死亡,有报道示:miR-21可能通过S100/RAGE信号通路发挥其调节作用,基于RAGE信号通路参与了中枢神经系统保护作用,我们研究miR-21在帕金森病中的作用。帕金森病和阿尔茨海默病一样,是一种中枢神经系统退化性疾病。研究显示,miR-21可作用于溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A),高表达的miR-21可明显降低PD模型中LAMP2A的表达,LAMP2A可以导致分子伴侣介导的自噬活动增加,CMA是减少α-synuclein蛋白的重要信号通路,但是京尼平苷对帕金森病脑保护作用是否与通过调节miR-21的表达有关尚不清楚。在本研究中,通过体内体外实验研究来探讨京尼平苷对帕金森病大鼠模型的的脑保护作用潜在的具体机制,来探讨京尼平苷在帕金森病模型中神经保护作用。第一部分建立稳定的帕金森病细胞模型方法:1,用不同浓度MPP+(OmM、1mM、2mM、4mM)诱导人神经母细胞瘤细胞作用时间持续48小时;选择合适的MPP+浓度来建立急性PD细胞模型;2,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒对细胞活性进行检测;3,针对已建立的PD细胞模型,用乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)试剂盒检测乳酸脱氢酶表达水平。4,用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒检测细胞内活性氧含量;结果1,用不同浓度的MPP+诱导SH-SY5Y细胞,细胞的损伤随其浓度的增加活性明显下降;2,用浓度1mM的MPP+的来建立急性帕金森病细胞模型:3,以浓度为1mM的MPP+作用于SH-SY5Y细胞,细胞内ROS表达含量明显增加;4,以浓度为1mM的MPP+作用于SH-SY5Y细胞,细胞内LDH释放含量明显增加;结论采用浓度为1mM的MPP+作用于SH-SY5Y细胞,可极大地对细胞活性产生影响,促进了细胞内活性氧、乳酸脱氢酶的生成,可建立稳定的急性帕金森病细胞模型。第二部分探讨京尼平苷对帕金森病细胞模型中miR-21、LAMP2A、α-synuclein表达水平的影响方法1,MPP+诱导人神经母细胞瘤细胞建立稳定的帕金森病模型,栀子苷处理用MPP+预处理的人神胞瘤细胞系经母细SHSY5Y,采用qRT-PCR和Western bloting方法检测miR-21、LAMP2A和α-synuclein的mRNA和蛋白水平。2,分别用 miR-21 mimic 和 miR-21 inhibitor 转染 MPP+预处理的 SHSY5Y细胞(即细胞PD模型),测定LAMP2A、α-synuclein的mRNA和蛋白表达水平,以明确miR-21对LAMP2A、α-synuclein调控作用。3,分别用 miR-21 mimic 和 miR-21 inhibitor 处理 GP 预处理的 SHSY5Y 细胞,测定LAMP2A、α-synuclein的mRNA和蛋白水平,同时通过荧光素酶报告实验检验miR-21是否直接靶向LAMP2A调控其表达,以确定GP能否通过miR-21/LAMP2A 减少αα-synuclein 表达水平。结果1.miR-21在模型组表达高于正常对照细胞组,京尼平苷可明显下调miR-21表达;提高LAMP2A蛋白和基因表达水平,降低了α-synuclein在帕金森模型组表达。2.过度表达的LAMP2A可抑制miR-21上调α-synuclein的水平。3.miR-21 mimic可逆转京尼平苷对α-synuclein的下调;miR-21 inhibitor可明显增强京尼平苷下调α-synuclein表达水平;miR-21可直接靶向LAMP2A,有效地降低其mRNA水平。结论京尼平苷降低α-synuclein表达水可能通过降低miR-21表达、提高LAMP2A蛋白和基因表达水平有关;第三部分构建体外帕金森病小鼠模型,探讨GP对小鼠PD模型中miR-21、LAMP2A和α-synuclein表达水平的影响方法通过腹腔注射MPTP建立帕金森小鼠模型,小鼠随机分为:生理盐水、MPTP、MPTP+GP、MPTP+GP+miR-21 agomir四组。检测不同组别小鼠中脑黑质中TH+神经元体视学计数;qRT-PCR、Western blot 测定 miR-21、LAMP2A 和α-synuclein mRNA和蛋白变化。结果1.MPTP显著减少TH+细胞数,GP可减轻MPTP对中脑中多巴胺能神经元的损害;2.miR-21 agomir可抑制GP引起的TH+细胞数的增加。3.高表达的miR-21可有效地逆转GP上调LAMP2A水平,下调α-synuclein表达水平;结论:帕金森病动物模型中,京尼平苷脑保护作用可能通过影响miR-21/LAMP2A的表达,进而下调α-synuclein表达水平有关。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965;R-332
【图文】：

神经细胞,活力,帕金森病,细胞模型

第一部分建立稳定的帕金森病细胞模型分组、做好标记。检测前ｌｈ，在物药物处理细胞１０％的ＬＤＨ释放试剂，反复吹打后，继续进孵育，各孔的上清液约１２０｜ｘＬ，加入所需培养板中待测ＭＰＰ＋作用于ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞时所造成的损伤结验结果观察示：ＭＰＰ＋对ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞的损伤程度，ＰＰＴ浓度的增加而增加，当ＭＰＰ＋浓度为２ｍＭ、４ｍ至５０％以下，因此选ＩｍＭ作为给药浓度，建立稳ＭＰＰ邋＋逡逑

理ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞ＲＯＳ的释放增加逡逑ｃｒｅａｓｅｓ邋ＲＯＳ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｉｎ邋ＳＨ－ＳＹ５Ｙ邋ｃｅｌｌｓ（＊＊邋Ｐ＜Ｏ．Ｏ胞内ＬＤＨ的产生逡逑进行操作，ＭＰＰ＋诱导ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞ＬＬＤＨ逡逑１０００－１逡逑逦８００－逦W｜逡逑逦６００－逦ｉＢｑ＇逡逑－■邋｜逡逑ｉｌｌ逡逑Ｏ逦１逡逑ｍＭ逡逑

细胞,细胞内,步骤

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