伯氏疟原虫中PbGPI16相关功能的研究

发布时间：2020-08-22 08:18

【摘要】：目的:全世界范围内,每年约有2000万人感染疟疾,死亡大约40万人,其中死亡人数中70%发生在小于5岁的儿童。在疟疾感染过程中严重的并发症及脑疟是造成患者死亡的主要原因,疟原虫的很多自身成分如疟色素、核酸及疟原虫锚定蛋白(GPIs)均可诱发严重病理反应。GPIs为脂多糖复合体,很多细胞膜蛋白通过GPIs锚定于细胞膜发挥生物学功能。在疟原虫的各个发育阶段均有GPIs表达,其中很多重要的GPIs蛋白的功能已经被证明。在脑疟发生过程中,GPIs可以刺激TNF-α及其他前炎症因子的表达,从而诱发宿主严重的病理变化。疟原虫在蚊体内阶段,疟原虫本身的GPIs通过胰岛素途径诱导蚊体免疫细胞及内皮细胞表达一氧化氮合酶(NOS),从而引起按蚊卵黄泡凋亡进而产卵量下降,减少能量消耗保证疟原虫在蚊体内继续发育。在GPIs及其锚定蛋白转运到细胞膜之前,锚定蛋白的GPI锚定信号肽在内质网通过转酰胺反应由GPIs替换,GPI转酰胺酶(GPI-T)在这个修饰过程中发挥核心作用。GPI-T在各种生物体中保守表达,有5个亚基组成,在酵母等低等生物中,GPI-T包括Gaa1p,Gpi8p,Gpi17p Gpi16p及Gab1p,5种亚基形成2中亚复合体,由Gpi8p,Gpi16p及Gaa1p构成的核心复合体发挥主要生物学功能与Gab1p及Gpi17p构成的次要复合体。其中Gpi16p呈递锚定蛋白与Gpi8p核心蛋白结合,同时Gpi16p调节Gpi8p与Gaa1p的表达。本课题的目的在于对疟原虫中GPI-T复合体进行相关研究,分别分析Pb GPI16缺失对疟原虫自身生长发育的影响,Pb GPI16缺失对中间宿主小鼠的影响以及Pb GPI16缺失对终宿主按蚊的影响。研究方法:1.生物信息学分析。Pb GPI16基因与其同源基因选于疟原虫数据库Plasmo DB(http://www.plasmodb.org),蛋白信号肽及结构域分析应用SMART在线预测(http://smart.emblheidelberg.de/).应用Clustal W进行同源性比对分析。2.基因重组虫株建立.运用基因双交叉同源重组技术构建HA标签虫株及基因敲除虫株,HA标签虫株(pbgpi16-ha)在Pb GPI16羧基末端融合HA标签,基因敲除虫株(△pbgpi16)利用hdhfr表达结构代替全部pbgpi16编码序列,基因重组虫株均带有乙胺嘧啶抗药基因。3.Pb GPI16基因表达阶段确定。pbgpi16-ha标签虫株用于检测Pb GPI16表达阶段,间接免疫荧光实验(IFA)应用HA标签蛋白单克隆抗体检测pbgpi16-ha标签虫株HA标签融合蛋白,Pb GPI16表达阶段检测包括环状体、滋养体、裂殖体、雌雄配子体、雌雄配子、动合子及子孢子。4.基因敲除虫株△pbgpi16表型检测。健康BALB/c小鼠分别注射△pbgpi16感染红细胞及野生型伯氏疟原虫Plasmodium berghei(WT-PbA)感染红细胞,感染后吉姆萨染色检测小鼠感染率,同时检测小鼠死亡率变化。感染后第三天尾血吉姆萨染色检测配子体率、雌雄配子体比,光镜检测尾血培养雄配子出丝情况。同时进行体外动合子形成实验,利用Pbs21抗体检测动合子形成,荧光显微镜下计数动合子。选取感染率相近小鼠进行直接模饲实验,蚊子吸血10天后每组解剖不少于25只蚊子观察蚊子感染率及感染蚊子卵囊密度,模饲实验21天进行感染蚊子子孢子计数,同时分别取△pbgpi16及WT-PbA子孢子10000只尾静脉注射健康小鼠,观察小鼠血液感染情况。4.△pbgpi16实验性脑疟模型(ECM)病例变化检测。C57BL/6小鼠腹腔注射△pbgpi16或WT-PbA感染红细胞,在小鼠表现出ECM症状时进行血脑屏障检测试验(BBB),分离感染小鼠脑组织进行苏木素伊红染色(HE)检测脑内微血管阻塞及血管内皮损伤。免疫组组织化学染色检测血管内皮VCAM-1、ICAM-1及CD36表达情况。6.C57BL/6小鼠ECM细胞因子检测。提取小鼠组织RNA,实时定量PCR(q RT-PCR)检测小鼠脑组织中VCAM-1,ICAM-1,CD36,CXCL9,CXCL10及CXCR3 m RNA表达情况与小鼠脾组织中TNF-α,IFN-γ,TGF-β,IL-1β,IL-6,IL-10及IL-12m RNA表达情况。MSD检测ECM小鼠血清中TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-6,IL-12,TGF-β及IL-10含量,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠脾细胞培养上清中的TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-6,IL-12,TGF-β及IL-10含量。7.ECM中相关细胞检测。运用流式细胞技术计数ECM小鼠脑组织中CD8阳性细胞数量,脾组织中1型辅助性T细胞(Th1)、树突细胞(DCs)及调节性T细胞(Treg)数量。8.ECM小鼠脑组织及脾组织NF-κB检测。ECM小鼠分离脾细胞及脑中的淋巴细胞,提取细胞核蛋白,免疫印迹实验(western blot)实验检测细胞核内NF-κB含量。9.△pbgpi16感染按蚊产卵量检测。分别取4至6天蚊龄的按蚊50至100只,分别吸取WT PbA感染小鼠、△pbgpi16感染小鼠及健康小鼠的血液。吸血3天后进行产卵量计数,产卵量计数包括产卵数及解剖蚊体后蚊体内成熟的蚊卵。10.△pbgpi16感染按蚊凋亡相关基因检测。按蚊吸血后24小时,每组取5只吸血的蚊子,提取蚊子总RNA,q RT-PCR检测As NOS、As INR表达情况。11.统计学分析。实验数据均采用均值加减标准差分析,采用Kaplan-Meier log-rank检验进行生存分析,Student's t-test或者one-way ANOVA进行显著性差异分析,取p值小于0.05为显著差异。结果:1.Pb GPI16表达于P.berghei各个阶段并在各种疟原虫中高度保守。生物信息学分析表明Pb GPI16蛋白N端含有保守信号肽,靠近C端含有一个GPI转酰胺酶亚基16(Gpi16)机构域。根据Clustal W同源性比对发现Pb GPI16在疟原虫各种属中高度保守表达。IFA检测Pb GPI16表达阶段,荧光信号在疟原虫各个阶段均有检出,包括环状体、滋养体、裂殖体、雌雄配子体、雌雄配子、动合子及子孢子。2.Pb GPI16缺失疟原虫侵袭红细胞能力下降并影响蚊内阶段发育。△pbgpi16感染小鼠疟原虫感染率低于WT PbA感染小鼠,配子体率及雌雄配子体比无明显变化,雄配子出丝能力正常,但体外动合子培养实验结果显示△pbgpi16形成动合子数量明显少于WT PbA。直接模饲实验显示按蚊感染率无明显变化,但感染△pbgpi16按蚊卵囊密度相比WT PbA组明显降低,模饲实验21天子孢子计数△pbgpi16组子孢子数量相比WT PbA组显著减少。但小鼠尾静脉注射△pbgpi16子孢子可致小鼠感染。3.△pbgpi16感染C57BL/6小鼠脑疟病理变化减轻。WT PbA感染小鼠于感染后第6天表现出明显脑疟神经系统症状,多于感染后5至12天死亡,而△pbgpi16感染小鼠很少表现出明显的神经系统症状,多数小鼠死于感染12天后。BBB实验显示△pbgpi16感染小鼠血脑屏障破坏减轻,HE染色显示△pbgpi16感染小鼠脑内白细胞浸润血管数量明显少于WT PbA感染小鼠,同时血管内皮VCAM-1、ICAM-1及CD36表达明显减少,q TR-PCR显示脑内与脑疟发生相关的趋化因子CXCL9,CXCL10及CXCR3表达降低。4.△pbgpi16感染C57BL/6小鼠前炎症反应下降。△pbgpi16感染小鼠TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-6及IL-12表达量明显下降,同时脾中的Th1淋巴细胞及脑中的CD8~+淋巴细胞数量明显少于WT PbA感染小鼠。脾中表达MHCII及TLR-4的DCs细胞数量亦有明显下降,但IL-10与TGF-β抑炎症因子及Treg细胞数量表达相对升高。5.△pbgpi16感染C57BL/6小鼠NF-κB途径未活化。△pbgpi16感染小鼠6天后,Western blot检测小鼠脾细胞及脑淋巴细胞细胞核内NF-κB表达,结果显示△pbgpi16感染组细胞核内NF-κB表达明显低于WT PbA组,结果提示△pbgpi16感染小鼠免疫细胞包浆内NF-κB未能激活进入细胞核内调控后续相关基因的表达。6.Pb GPI16缺失疟原虫感染按蚊抑制卵巢凋亡。△pbgpi16感染按蚊产卵量明显高于WT PbA感染按蚊。按蚊感染疟原虫后,疟原虫GPIs激活外源性胰岛素途径促使NOS表达,进而激活按蚊体内凋亡途径。△pbgpi16感染按蚊As NOS表达量明显低于WT PbA感染按蚊。结论:1:Pb GPI16表达于疟原虫各个阶段并在各种疟原虫中高度保守2:Pb GPI16缺失影响疟原虫侵袭红细胞及蚊体内发育3:Pb GPI16在ECM中发挥关键作用4:Pb GPI16缺失不能激活按蚊自身细胞凋亡途径
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R382.31
【图文】：

示意图,示意图,跨膜蛋白,复合体结构

图 2：GPI-T 复合体转酰胺反应示意图。GPI-T 在各种生物体中保守表达，在人类细胞中，GPI-T 有由 5 个亚基组成，包括 GAA1、GPI8、PIG-S、PIG-T 及 PIG-U，在酵母等低等生物中，GPI-T 包括Gaa1p, Gpi8p, Gpi17p Gpi16p 及 Gab1p（图 3）[42, 43]。5 种亚基形成 2 中亚复合体，由 Gpi8p, Gpi16p 及 Gaa1p 构成的核心复合体发挥主要生物学功能与 Gab1p及 Gpi17p 构成的次要复合体[44]。其主要复合体中，Gaa1p 为多次跨膜蛋白，镶嵌在内质网膜上，Gpi8p 与 Gpi16p 均为单次跨膜蛋白，嵌插于内质网膜，二者之间通过二硫键连接，同时与 Gaa1p 结合形成复合体结构。Gpi8p 在整个复合体中发挥酶催化作用，与 Gaa1p 共同完成转酰胺反应，其中 Gpi16p 呈递锚定蛋白与 Gpi8p 核心蛋白结合[45]，同时 Gpi16p 调节 Gpi8p 与 Gaa1p 的表达[9]。

低等生物,亚基组成,人类,亚基

图 3：人类及低等生物中 GPI-T 复合体各亚基组成。其中标记为红色亚基为 PbGPI16 同源亚基。以上理论基础，目前尚未有关于疟原虫 GPI-T 复合体的研究报基于研究疟原虫中 GPI-T 复合体的生物信息学分析确认了 Pb虫中 GPI-T 复合体中的亚基之一，对 PbGPI16 的表达阶段进行研究了 PbGPI16 缺失对伯氏疟原虫各个发育阶段的影响。

示意图,伯氏疟原虫,亚基,示意图

3.1 伯氏疟原虫 GPI-T 组成经生物信息学分析，伯氏疟原虫中 GPI-T 包含 GPI8、GPAA1 及 GPI16 组成，其中 PbGPI8 含有 462 个氨基酸，蛋白 C 端还有信号肽序列，还有一个跨膜区及一个转酰胺 C13 超家族结构。PbGPAA1 包含 755 个氨基酸，蛋白包含 6 个跨膜结构及一个 GPI-T 复合体 GPAA1 亚基结构域。PbGPI16 包含 512 个氨基酸，蛋白C端还有一个信号肽序列，N端含有一个跨膜区，另外靠近N端还有一个GPI-T复合体 GPI16 亚基结构域。PbGPI8、PbGPAA1 及 PbGPI16 蛋白结构与酵母等低级生物中 GPI-T 主要复合体相似，即 GPI8 与 GPI16 均为单次跨膜蛋白，二者通过二硫键连接，GPAA1 为多次跨膜蛋白镶嵌于内质网上，与 GPI8 及 GPI16 共同发挥生物学作用 (图 4)。3 结果

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