去泛素化酶USP48调节TNFα信号转导通路中TRAF2蛋白稳定性的研究

发布时间：2020-09-02 14:16

　　研究背景在急性炎症或者全身炎性反应时,肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNFα)的表达升高伴随着组织器官上皮完整性的破坏,进而导致间隙增大,通透性增加,蛋白和液体渗漏,严重时引起器官功能障碍。在细胞水平,肿瘤坏死因子α可以使E-钙黏蛋白表达下降。E-钙黏蛋白的下调或缺失,降低细胞与细胞之间粘附的程度,进而导致上皮细胞的通透性和细胞活动性的增加。深入了解E-钙黏蛋白调节的分子机制,有助于提高我们对上皮屏障功能障碍引起的疾病的认识。肿瘤坏死因子受体相关因子2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2)是一种重要的接头蛋白,参与肿瘤坏死因子α介导的信号级联反应,并发挥重要作用。TRAF2在肿瘤坏死因子α的刺激后能够募集到TNFR1或者TNFR2,调节NF-κB和c-Jun N terminal kinase(JNK)信号级联反应的激活。JNK参与调节E-钙黏蛋白介导的细胞粘附连接已经被报道,但是TRAF2是否参与调节E-钙黏蛋白的表达尚无阐述。研究表明,泛素化修饰参与调节TRAF2的活性,但是哪种去泛素化酶能够调节TRAF2蛋白稳定性还需探索。最近有研究表明,去泛素化酶USP48,也称做USP31,能够与TRAF2蛋白相互结合,但是否影响TRAF2蛋白的活性和稳定性还尚无论证。目前USP48的生理功能还不是很明确,但其广泛表达于各种组织器官中,提示可能参与多种必需的去泛素化过程。因此本课题拟深入研究去泛素化酶USP48和TRAF2结合的生理意义及其是否影响下游信号转导通路。研究方法1.通过免疫印迹法明确US48对TRAF2蛋白水平的影响;通过实时荧光定量PCR检测USP48对TRAF2 m RNA水平的影响。2.通过细胞内泛素分析检测USP48对TRAF2泛素化的影响;通过免疫共沉淀明确USP48和TRAF2的相互结合;通过免疫染色明确USP48和TRAF2的细胞内定位。3.通过免疫沉淀反应检测TNFα和GSK3β使USP48发生磷酸化;通过免疫共沉淀明确USP48和GSK3β的相互结合;通过免疫染色明确USP48和GSK3β的细胞内定位。4.通过免疫印迹法明确GSK3β对TRAF2蛋白水平表达的影响;通过细胞内泛素分析检测GSK3β对TRAF2泛素化的影响。5.通过体外合成系统合成重组的USP48野生型和突变型蛋白;通过体外去泛素化酶活性分析试剂盒检测USP48对K-48多聚泛素链的水解能力。6.通过免疫印迹法明确USP48、JNK、TNIK对E-钙黏蛋白蛋白水平的影响;通过实时荧光定量PCR检测USP48、JNK、TNIK对E-钙黏蛋白m RNA水平的影响。7.通过细胞-基质电阻抗测量技术检测USP48、JNK、TNIK对跨上皮细胞电阻抗值的影响。研究结果1.USP48能够使TRAF2蛋白稳定。1)通过转染Si RNA敲降USP48或转染USP48C98S-V5质粒抑制USP48催化活性可明显减少TRAF2蛋白水平;2)敲降USP48对TRAF2 m RNA水平无影响;3)过表达USP48延长TRAF2蛋白的半衰期。2.USP48去泛素化TRAF2发生在细胞质。1)通过转染USP48-V5质粒过表达USP48能够减少TRAF2蛋白的泛素化水平;2)抑制USP48活性增加TRAF2蛋白的泛素化水平;3)敲降USP48增加TRAF2蛋白K-48位点的多聚泛素化水平;4)USP48和TRAF2在细胞质中有共同定位。3.GSK3β调节TNFα介导的USP48磷酸化。1)TNFα和GSK3β可以使USP48发生磷酸化;2)USP48结构域内含有GSK3β的磷酸化区域;3)抑制GSK3β能够抑制TNFα介导的USP48磷酸化;4)USP48和GSK3β在细胞质有共同定位。4.USP48磷酸化有利于TRAF2蛋白稳定。1)抑制GSK3β促进TRAF2蛋白降解;2)抑制GSK3β促进TRAF2蛋白泛素化;3)过表达GSK3βS9A减弱TRAF2蛋白泛素化;4)过表达USP48磷酸化位点失活质粒降低TRAF2蛋白稳定性;5)过表达USP48磷酸化位点失活质粒增加TRAF2蛋白泛素化。5.GSK3β磷酸化USP48增强其去泛素化酶活性。1)抑制GSK3β或过表达USP48磷酸化位点失活质粒对TRAF2和USP48之间相互结合无影响;2)抑制GSK3β削弱USP48去泛素化TRAF2;3)USP48磷酸化位点失活导致其去泛素化酶活性降低;4)GSK3βS9A增强USP48去泛素化酶活性。6.敲降USP48削弱TRAF2介导JNK1激活,进而增加E-钙黏蛋白表达。1)敲降USP48削弱TNFα介导的JNK1和c-Jun的磷酸化;2)敲降USP48增加E-钙黏蛋白表达;3)抑制JNK削弱TNFα使E-钙黏蛋白表达下调;4)抑制TNIK削弱TNFα使E-钙黏蛋白表达下调;5)敲降USP48削弱TNFα使E-钙黏蛋白表达下调;6)敲降USP48增加E-钙黏蛋白m RNA水平;7)抑制JNK或TNIK增加E-钙黏蛋白m RNA水平。7.敲降USP48或抑制JNK或TNIK增加上皮屏障完整性。1)敲降USP48增加跨上皮细胞电阻抗值;2)抑制JNK或TNIK增加跨上皮细胞电阻抗值;3)敲降USP48促进LPA使跨上皮细胞电阻抗值升高。研究结论1.GSK3β磷酸化USP48增强其去泛素酶活性,有利于使TRAF2蛋白更稳定,促进TNFα使JNK激活;2.下调USP48仅影响TNFα使JNK激活,对TNFα使NF-κB激活无影响;3.抑制JNK或TNIK能增加E-钙黏蛋白表达和上皮屏障完整性。4.下调USP48通过影响JNK,能够增加E-钙黏蛋白表达和上皮屏障完整性。
【学位单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R346
【部分图文】：

信号通路

大连医科大学博士学位论文端结构域和 TRAF-C 端结构域, 能够参与蛋白质的寡聚化，以及与其他信号分子之间的相互作用[16-18]。TRAF2 参与调节多种信号转导通路，在 TNFα 的刺激下，TRAF2能够募集 TNFR1 或 TNFR2，继而激活 NF-κ B 和 JNK 信号级联反应[19-22]（图 1）。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）中的重要分支，JNK 信号通路在TNFα 信号通路中有多重作用，其可以参与介导炎症、创伤修复、细胞增殖及细胞凋亡等多种生物学过程[23-25]。最近有越来越多的证据表明，JNK 参与调节 E-钙黏蛋白介导的上皮细胞之间粘附连接，JNK 通过结合 E-钙黏蛋白/β -catenin 复合体，进而磷酸化 β -catenin 蛋白，参与粘附连接的形成，并控制细胞与细胞之间的粘附[26-28]。但是 TRAF2 是否有直接影响 E-钙黏蛋白的表达的作用还未曾报道。

示意图,泛素,示意图,半胱氨酸

大连医科大学博士学位论文结构和功能复合体，属于蛋白质翻译后修饰的种，能够调节靶蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位。泛素化修饰是个精细调控的过程，其中有多种酶的参与，包括 E1-泛素活化酶，E2-泛素偶联酶和 E3-泛素连接酶。E1-泛素活化酶通过 ATP 水解作用形成高能硫酯键将 E1 酶半胱氨酸与泛素分子羧基末端连接在起，以激活泛素；E2-泛素偶联酶将 E1 半胱氨酸残基上结合的泛素分子转移到E2 活化的半胱氨酸位点；E3-泛素连接酶能够将泛素分子与底物蛋白特异性的连接在起，进而完成泛素化修饰的过程[29-31]（图 2）。

泛素化,泛素

11图 3 泛素化修饰及意义[32]去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）可以逆转蛋白质泛素化的过程，将泛素分子从靶蛋白上水解下来，决定靶蛋白的命运并影响下游的细胞内反应[39]。去泛素化酶主要有三种功能：第，将单个泛素分子从泛素前体中游离下来；第二，将多聚泛素链从蛋白酶体上游离下来，循环利用蛋白质降解后释放出的泛素分子；第三，修饰泛素链，参与信号转导[39-41]。因此，去泛素化酶可以调节蛋白稳定性、活性、数量以及在亚细胞水平的分布，在多种信号转导通路中发挥作用。基于去泛素化酶结构相似性和作用机制，目前 DUBs 主要分为以下五种类型：泛素特异蛋白酶 (ubiquitin-specific protease，USP)、泛素羧基末端水解酶 (ubiquitin C-terminal hydrolase，UCH)、卵巢肿瘤蛋白酶（Ovarian-tumorprotease, OTU）、Machado-Joseph 疾病蛋白酶（Machado-Joseph disease proteases,

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