NM23在肝细胞增殖过程中的作用

发布时间：2017-04-01 23:04

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【摘要】：第一部分；NM23-E2过表达和干扰载体的构建、扩增、鉴定目的：构建、扩增、鉴定、筛选NM23-E2过表达和干扰载体,为后续实验奠定理论基础。方法：1.NM23-E2与HPV-16、E6、E7慢病毒构建慢病毒载体并测序；2.重组慢病毒质粒的提取；3.构建的NM23-E2慢病毒转染HEK293T细胞：4.Q-PCR检测病毒滴度；5.重组的NM23-E2慢病毒感染HEK293T细胞及筛选；6.NM23-E2 mRNA的RT-PCR检测；7.NM23-E2蛋白Western blot检测。结果：成功构建NM23-E2过表达和干扰慢病毒载体并测序验证无误；通过转染HEK293T细胞,测定病毒滴度； 应用Q-PCR、Western-blot检测从shRNA1、 shRNA2、shRNA3、shRNA4四个干扰序列中筛选出干扰效果最佳的shRNA1作为干扰载体。结论：成功构建NM23-E2的慢病毒载体,测序正确,筛选出干扰效果最佳的干扰载体及高表达的过表达载体。第二部分： NM23-E2在肝细胞增殖过程中的作用目的：研究NM23-E2基因在BRL-3A细胞增殖过程中的作用方法：实验分五组：1、对照组(control),未经任何处理2、过表达组(ExpNM23-E2),转染NM23-E2过表达载体；3、过表达NC组(Exp NC),转染NM23-E2过表达阴性对照载体,4、干扰NC(shRNA NC),转染NM23-E2干扰阴性对照载体；5、干扰组(shRNA1),转染NM23-E2干扰载体。将包装好的上述五种载体分别转染大鼠BRL-3A细胞,转染后第五天应用Q-PCR检测BRL-3A细胞NM23-E2、PCNA、Cyclin D1 mRNA的表达,应用Western-blot检测BRL-3A细胞NM23-E2、PCNA、Cyclin D1蛋白的表达,应用CCK8检测BRL-3A细胞转染1-5天后的细胞增殖情况。结果：PCR：检测BRL-3A细胞NM23-E2、PCNA、Cyclin D1 mRNA的表达：NM23-E2过表达组三种蛋白mRNA的表达量均高于空白对照组(P0.05),shRNA干扰组三种蛋白mRNA的表达量均低于空白对照组(P0.05),差异有统计学意义。Western-blot:检测BRL-3A细胞NM23-E2、PCNA、CyclinD1蛋白的表达：NM23-E2过表达组三种蛋白表达量均高于空白对照组(P0.05), shRNA干扰组三种蛋白表达量均低于于空白对照组(P0.05),差异有统计学意义。CCK8：检测大鼠BRL-3A细胞增殖情况,NM23-E2过表达组细胞增殖数目明显高于空白对照组和载体NC组细胞(P0.05),shRNA干扰组细胞增殖数目明显低于空白对照组和载体NC组细胞(P0.05),差异有统计学意义。结论：运用慢病毒载体携带过表达及干扰的NM23-E2可有效地转染到BRL-3A细胞。过表达的NM23-E2载体对BRL-3A细胞再生调控作用成正向调控作用,shRNA载体对BRL-3A细胞再生调控作用成负向调控作用。
【关键词】：NM23-E2 质粒 HEK293T细胞 转染 Q-PCR Western-blot NM23-E2 干扰 过表达 BRL-3A 细胞 CCK8
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3416
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 符号说明10-11
• 第一部分：NM23-E2过表达和干扰载体的构建、扩增、鉴定11-39
• 前言11-12
• 材料和方法12-27
• 结果27-34
• 讨论34-36
• 小结36-37
• 参考文献37-39
• 第二部分：NM23-E2在肝细胞增殖过程中的作用39-60
• 前言39-40
• 材料和方法40-47
• 结果47-54
• 讨论54-57
• 小结57-58
• 参考文献58-60
• 综述60-64
• 参考文献63-64
• 攻读学位期间发表文章情况64-65
• 致谢65

【参考文献】

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1 张谷裕;刘国华;林满洲;李明意;杨永光;许浩;;维生素K2促进大鼠肝再生模型肝切除术后肝功能恢复的研究[J];实用医学杂志;2013年01期

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本文编号：281438