MCU介导线粒体分裂蛋白Drp-1在人中性粒细胞迁移中的作用

发布时间：2017-04-01 08:13

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【摘要】：背景嗜中性粒细胞(Polymorphonuclear nertrophils, PMNs)占白细胞总量的80%以上,在血液的非特异性细胞免疫系统中发挥重要的作用,它处于机体抵御病原微生物、特别是在化脓性细菌入侵的第一线。成熟的中性粒细胞从骨髓中释放出来,以静息状态在外周血中循环,当炎症发生时,它们被趋化性物质刺激后,迅速启动细胞内一系列复杂的信号级联反应,胞内蛋白和细胞骨架重新分布,几分钟后,细胞呈现出头部宽大而尾部狭长的极性化状态,然后快速的穿越血管内皮定向移动到感染部位,发挥杀菌致炎症的作用。由于中性粒细胞内含有大量溶酶体酶,因此能将吞噬入细胞内的细菌和组织碎片在吞噬包内分解。临床上的一些疾病如慢性阻塞性肺疾病、哮喘、类风湿性关节炎、败血症、动脉粥样硬化、缺血/再灌注损伤、病毒性心肌炎、过敏反应、炎症性皮肤病甚至肿瘤的发生和转移都和中性粒细胞迁移功能有关。因此深入探讨中性粒细胞极性化过程中的信号机制,对寻找新的治疗和干预靶点,防止中性粒细胞异常激活导致的组织损伤具有重要意义。中性粒细胞受到炎症释放的介质等化学因子的作用后,可以朝该化学因子浓度高的方向移动,这种现象称为趋化作用(chemotaxis),该化学物质称为趋化因子(chemotactic factor)。中性粒细胞的趋化因子有两类：一类是自身组织损伤释放的因子,例如胶原和纤维蛋白片段、白细胞介素8(intermediate chemoattractants, IL-8)及补体活化产物等；另一类是微生物来源的含有N-早酰蛋氨酸残基的多肽,例如甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,fMLP)。fMLP和IL-8代表两类不同作用类型的趋化因子,fMLP刺激作用最强,它先与G蛋白偶联甲酰肽受体(formyl peptide receptor 1, FPR-1)和类甲酰肽受体(formyl peptide receptor like-1, FPRL-1)结合通过不依赖PI3K的P38 MAPK途径激活中性粒细胞.而IL-8则与G蛋白偶联受体家族CXCR1和CXCR2结合通过以PI3K依赖的信号通路来完成的。所以本研究采用了fMLP和IL-8这两种趋化因子来作为刺激中性粒细胞的趋化剂进行实验。细胞内游离Ca2+浓度(cytosolic free Ca2+ concentration)升高被认为参与中性粒细胞应对外界刺激物的各种生理病理反应,包括趋化和迁移、活性氧的产生等。中性粒细胞趋化剂作用于人中性粒细胞胞膜上的G-蛋白偶联受体,激活磷脂酶C水解成1,4,5-肌醇三磷酸(D3)和二酰甘油(DAG),IP3与内质网上的IP3受体结合,从而诱导内质网钙库释放Ca2+,内质网Ca2+清空可以激活细胞膜上的钙库耗竭调节钙内流通道(store-operated calcium entry. SOCE),使胞质内Ca2+浓度升高。DAG可以激活受体调节钙内流通道(receptor-operated calcium entry, ROCE),也使胞质内Ca2+浓度升高。内质网和线粒体都是钙库,内质网可以储存约500μM Ca2+,内质网Ca2+排空将使细胞质内Ca2+浓度从0.1μM上升到1μM,若进一步上升则大大增加全细胞钙离子毒性,此时线粒体Ca2+缓冲系统有效地防止全胞内Ca2+异常升高。意大利的Rizzuto发现线粒体可以储存100-300pM的Ca2+。从IP3通道流出来的Ca2+能够通过线粒体外膜的VDAC通道,接着流入线粒体内膜上的一个钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter, MCU)。50年多前,人们就开始知道线粒体是通过位于线粒体内膜上的低亲和力、高选择性的离子通道线粒体钙单向转运体MCU,跨内膜膜电位(△Ψm)(内负)是使Ca2+在线粒体基质蓄积的驱动力,线粒体通过钙单向转运体MCU摄取Ca2+是依靠内负的膜电位而不是共转运其他离子也不与ATP偶联,MCU的分子组成一直无法确定。直到2011年哈佛大学医学院和马萨诸塞综合医院研究人员通过查阅人类基因组项目数据库资料并结合实验分析,终于发现了驱动线粒体钙通道机制的关键蛋白CCDC109A,即MCU。 MCU定位于线粒体内膜,由MICU1、 MICUR1(调节伴侣)和MCU(成孔亚基)组成。尽管MCU与Ca2+亲和力低,但当细胞受到刺激时,线粒体的基质Ca2+浓度能迅速改变,这是因为线粒体与内质网或质膜上的Ca2+通道相邻,线粒体低亲和力的摄钙系统暴露于高Ca2+浓度的微域,从而有利于线粒体的摄入。迄今的文献已经表明MCU参与的线粒体内Ca2+内稳态介导多种细胞反应,一方面在维持细胞内Ca2+信号和震荡起着缓冲作用,另一方面可以对线粒体本身的物质和能量代谢、细胞分裂和分化、细胞生存和死亡等均具有重要的调节功能。线粒体是一种处于高度运动状态的细胞器,频繁地出现分裂和融合,线粒体分裂、融合和沿微管定向移动的过程被称为线粒体动力学。随着分裂和融合蛋白突变引起的众多凋亡和自噬的发现,线粒体分裂和融合被认为是细胞生存的基石,对健康和疾病有重要的影响。线粒体动力学包括线粒体在细胞中融合与分裂,其形态分布不断地变化,形成动态平衡,以对不同生理功能和不同区域细胞能量的需要进行“整合性应答”,在维持包括细胞极性、应激反应和凋亡自噬等细胞稳态的过程中起着重要的作用。线粒体动力学是裂解和融合动态平衡的过程。调节裂解的主要蛋白有动态相关蛋白1(dynamin-related protein-1,Drp-1)和接头蛋白1 (fission protein-1, Fis-1), Drp-1是一种进化上保守的GGTP酶,受翻译后磷酸化ser-616修饰而激活,通过接头蛋白Fis-1定位并募集于线粒体膜进而调节线粒体的分裂,募集的位置通常位于线粒体-内质网接触的位置,该位置富含Drp-1的受体Mff,这被称为内质网标记的线粒体分裂位点(ER-associated mitochondrial division, ERMD),研究发现成蛋白INF2和myosin Ⅱ等细胞骨架蛋白在ERMD的形成过程中也起着重要的作用；调节线粒体分裂的Drp-1。可见,线粒体形态动力学的变化参与着细胞内信息传递和能量代谢,并与细胞的生理病理改变密切相关。其中在介导线粒体分离方面最重要的蛋白是Drp-1, Drp-1是一种受到Ca2+信号或Ca2+依赖蛋白调节的苏氨酸/丝氨酸激酶,在结构上289-319节段包含典型的CaM调节区域,其磷酸化受到胞外Ca2+信号的调节。这种Ca2+信号与细胞不同区域Ca2+信号有关,另一方面,Drp-1在Ser-637的磷酸化则可以抑制GTP酶的活性和线粒体的分裂。在线粒体融合方面,线粒体融合蛋白(mitofusin, Mfn)调节线粒体外膜融合,Opal (optic atrophy-1, Opal)蛋白调节线粒体内膜融合,Mfn蛋白包括Mfnl和Mfn2两个亚型,定位于线粒体外膜上,其N端结构域(GTP酶结构域)和C端结构域均朝向细胞浆；Mfnl和Mfn2相互作用调节不同线粒体外膜的融合。Opal定位于线粒体内膜,主要参与线粒体嵴的重构和内膜的融合。内膜和外膜各自独立地融合,但最近研究表明,Opal的促融合作用有赖于Mfnl的参与。目前对涉及线粒体动力学的信号通路的研究主要包括Ca2+信号通路、Notch、 NF-κB、Wnt等信号通路,这些信号通路或参与线粒体动力学的调节,或与线粒体动力学一起参与细胞生老病死等状态的调节。线粒体作为细胞生物氧化和能量转换的主要场所,为机体提供90%以上的能量,而且线粒体中也存在类似中性粒细胞趋化物fMLP的甲酰基肽,经推测线粒体动力学或钙信号在中性粒细胞迁移中有作用,但没有相关研究。目的本研究通过均一、低浓度fMLP口IL-8刺激人中性粒细胞建立极性和趋化模型,首先进行慢性阻塞性肺疾病病人中性粒细胞极性化实验和western-blotting检测,初步研究MCU通道蛋白与中性粒细胞极性化的关系,采用MCU通道蛋白抑制剂Ru360、激动剂spermine和线粒体分裂蛋白Drp-1抑制剂Mdivi-1预处理中性粒细胞,通过Zigmond Chamber、Transwell、免疫印迹技术、confocal、 western-blotting观察细胞形态、骨架蛋白分子聚合F-actin、线粒体分布情况、细胞质内和线粒体内钙离子变化情况和线粒体分裂蛋白的表达情况,探讨MCU通道蛋白介导线粒体分离在中性粒细胞迁移中的作用。方法1.采用经典的梯度密度离心的方法分离中性粒细胞,主要包括红细胞沉降,淋巴细胞分离液密度梯度离心和低渗裂解残存的红细胞三个步骤。获得的中性粒细胞进行台盼蓝染色和瑞氏-吉姆萨染色,分析细胞活性和纯度,细胞的活度和纯度分别大于98%和95%。2.不同浓度的Ru360或spermine于37℃预处理中性粒细胞30分钟,用Zigmond Chamber建立fMLP或IL8的线性浓度梯度,观察中性粒细胞的极性改变。3.不同浓度的Ru360或spermine于37℃预处理中性粒细胞30分钟,采用Transwell小室实验检测中性粒细胞的迁移能力的变化。4.采用细胞免疫荧光方法在激光共聚焦显微镜上检测聚合F-actin和线粒体在胞内的分布。5.使用钙离子敏感性指示剂fluo4/AM和rhod2预处理中性粒细胞在激光共聚焦显微镜下监测细胞内和线粒体内钙离子浓度的变化。6.采用Western-blotting检测MCU、Drp-1、磷酸化Drp-1(616)和磷酸化-Drp-1(637)的蛋白含量改变情况。7.实验数据用均数±标准差(x±SD)表示,数据经SPSS13.0软件处理分析。三组及三组以上样本均数比较满足方差齐性用One-way ANOVA方差分析,组间两两比较采用LSD法；若方差不齐,采用welch检验,组间两两比较采用Dunnett's T3法。p0.05为存在显著性差异。结果1.慢性阻塞性肺疾病病人的中性粒细胞极性化率明显减低(p0.01), MCU通道蛋白表达明显减少(p0.01)。2.MCU通道蛋白抑制剂Ru360预处理的中性粒细胞从10μM的剂量组开始出现极性化数量明显减少(p0.01), MCU通道蛋白激动剂spermine预处理的中性粒细胞从20μM的剂量组开始出现极性化数量明显增多(p0.01)。Ru360预处理中性粒细胞从10μM的剂量组开始出现迁移数量明显减少(p0.01)。spermine预处理的中性粒细胞从10μM的剂量组开始出现迁移数量明显增多(p0.05)。3.10μMRu360抑制IL-8诱导的中性粒细胞的极性化和趋化(p0.01),20μMspermine促进IL-8诱导的中性粒细胞的极性化和趋化(p0.01)。4.聚合的F-actin在荧光下显示为红色,静息状态下的中性粒细胞中质膜下红色荧光呈现对称分布,fMLP刺激后的中性粒细胞出现明显的不对称红色荧光,细胞头部荧光增强且数量多,尾部也有荧光聚集。10μM Ru350处理组又恢复对称分布,20pM spermine处理组荧光不对称分布更明显。5.10μM Ru360和20μM spermine预处理的MCU通道蛋白表达未见明显差异(p0.05),对胞质内的Ca2+影响也不大(p0.05),参与中性粒细胞极性化和趋化的关键蛋白μ-calpain活性也未见明显差异(p0.05)。6.10μMRu360抑制中性粒细胞线粒体的Ca2+摄取(P0.01),而20μM spermine促进线粒体的Ca2+摄取(p0.01)。7.中性粒细胞在静息状态下,线粒体呈现分枝样的管状网络结构,分布在细胞中间,而fMLP刺激后线粒体出现散点状,主要位于尾部,10μMRu360预处理后线粒体又呈现分枝样的管状网络结构,分布在细胞中间。20pM spermine预处理后线粒体呈现散点状更明显,主要位于尾部。8.10μMRu360预处理中性粒细胞的P-Drp1(Ser616)蛋白表达减弱(p0.05),20μM spermine预处理P-Drp1(Ser616)蛋白表达增强(p0.05)。9.线粒体分裂蛋白Drp-1抑制剂Mdivi-1从5μM开始出现中性粒细胞极性化和迁移细胞数量降低(p0.05)抑制中性粒细胞的极性化和趋化。结论1.MCU通道蛋白在中性粒细胞极性化和趋化过程中起着重要的作用。2.MCU通道蛋白对中性粒细胞极性化和趋化的影响是通过影响线粒分裂蛋白Drp-1来实现的。
【关键词】：MCU 中性粒细胞 极性化 趋化
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-25
• 材料和方法25-38
• 1. 材料25-30
• 1.1 中性粒细胞25
• 1.2 主要试剂25-26
• 1.3 主要溶液的配制26-30
• 1.4 实验仪器30
• 2. 实验方法30-37
• 2.1 中性粒细胞分离30-31
• 2.2 中性粒细胞纯度和活力测定实验31-32
• 2.3 中性粒细胞的药物预处理和刺激32
• 2.4 中性粒细胞细胞极性化实验32-33
• 2.5 中性粒细胞趋化实验33-34
• 2.6 中性粒细胞聚合F-actin的免疫荧光测定34
• 2.7 细胞质内游离Ca~(2+)浓度检测34-35
• 2.8 线粒体内游离Ca~(2+)浓度检测35
• 2.9 μ-calpain活性测定35
• 2.10 中性粒细胞线粒体分布荧光测定35-36
• 2.11 免疫印迹36-37
• 3. 数据处理37-38
• 结果38-53
• 1. 慢性阻塞性肺疾病病人对fMLP诱导的中性粒细胞极性化能力降低38
• 2. 慢性阻塞性肺疾病病人中性粒细胞的MCU通道蛋白含量减少38-39
• 3. MCU通道在人中性粒细胞极性化和趋化中的作用39-45
• 4. Ru360和spermine预处理对fMLP诱导人中性粒细胞的F-actin的聚合的影响45-46
• 5. Ru360和spermine预处理对中性粒细胞胞质内Ca~(2+)浓度及μ-calpain活性的影响46-48
• 6. Ru360和spermine预处理对中性粒细胞线粒体内Ca~(2+)摄取的影响48
• 7. Ru360和spermine预处理对中性粒细胞的线粒体形态和分布的影响48-49
• 8. Ru360和spermine预处理对中性粒细胞线粒体分裂蛋白的影响49-50
• 9. 线粒体分裂蛋白Drp-1抑制剂Mdivi-1预处理对中性粒细胞极性化和趋化的影响50-53
• 讨论53-58
• 全文小结58-59
• 参考文献59-63
• 英文缩略词表63-64
• 硕士期间发表论文64-65
• 致谢65-66

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王称心;宋质银;;线粒体蛋白酶对线粒体动力学的调控及机理[J];安徽农学通报;2015年10期

2 骆静;方丽;袁琦;蔡婷;杨俊伟;;线粒体功能障碍在糖尿病肾病进展的作用[J];现代生物医学进展;2015年20期

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 余岳;KIF22调控乳腺癌增殖和转移的双向作用及机制[D];天津医科大学;2014年

2 谢青松;线粒体融合蛋白2诱导肝癌细胞凋亡的分子机制的研究[D];浙江大学;2015年

3 于滢;一次大负荷运动对大鼠骨骼肌线粒体分布和功能影响及针刺干预作用[D];北京体育大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 纪云松;BDNF诱导线粒体在突触前的定位并增强其引起的突触传递作用[D];山东大学;2013年

2 贾晓菲;玉米胚性愈伤发生相关基因ZmKHCP和ZmTypA的功能研究[D];吉林大学;2014年

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本文编号：280302