靶向血小板凝血因子Xa转基因小鼠的建立及功能鉴定

发布时间：2020-09-14 15:26

　　 目的:通过靶向血小板的启动子控制凝血因子Xa(FXa)的表达,将FXa靶向表达于血小板中,并依此构建FXa转基因小鼠模型。通过FXa转基因小鼠验证靶向血小板表达FXa对于血友病B(HB)的治疗作用。对于血小板异位表达FXa治疗血友病的基因治疗方法进行深入研究,确定该方法是否能够安全有效的治疗血友病,解决目前血友病治疗过程中出现的问题。方法:选用巨核细胞和血小板特异的αIIb启动子控制FXa的表达构建血小板特异的FXa表达载体(2bFXa)。αIIb启动子可在小鼠造血干细胞分化产生血小板的过程启动表达产生FXa,从而达到在血小板中特异表达与储存FXa的目的。我们将以血友病B小鼠为主要模型,制备2bFXa转基因血友病B小鼠,在转基因小鼠上首先通过FXa ELISA测定FXa的浓度、以化学发光法测定FXa的活性、Western Blot分析FXa蛋白分子特性,再以激光共聚焦显微术确定FXa在血小板中的表达定位,最后通过小鼠的出血量试验和截尾生存实验确定小鼠的止血改善情况。结果:构建了2bFXa靶向血小板表达框架,成功制备了2bFXa-HB转基因小鼠模型。尾静脉收集小鼠静脉血,分离血小板,在血小板中测定了FXa的浓度与活性,表明转基因小鼠构建成功。通过Western Blot实验分析确定了靶向表达于血小板中FXa蛋白的分子特性。通过对HB小鼠,野生型(WT)小鼠及2bFXa-HB转基因小鼠进行出血量试验比较,经统计得出WT2bFXa-HBHB,2bFXa-HB转基因小鼠的出血量明显小于HB小鼠(P0.0001),说明FXa发挥了显著的止血作用;进一步在截尾生存实验中所有2bFXa-HB转基因小鼠都存活,证明小鼠的出血症状得到治疗。通过激光共聚焦免疫荧光显微术确定了FXa成功靶向表达在血小板中的α颗粒中。结论:2bFXa-HB转基因小鼠构建成功,FXa成功靶向表达于血小板中,且FXa具有活性,通过激光共聚焦荧光显微术分析进一步确定FXa在血小板表达。经治疗小鼠出血量较血友病小鼠显示减少,FXa发挥了凝血作用,截尾生存后,2bFXa-HB转基因小鼠存活率为100%,进一步说明治疗奏效。
【学位单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R-332;R554.1
【部分图文】：

FXa的结构示意图

对F0代小鼠进行基因型鉴定并检测FXa含量

血友病B小鼠基因型鉴定电泳图

【参考文献】

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本文编号：2818337