正常人肝10种细胞色素P450亚型的含量及活性

发布时间：2020-09-19 17:13

【摘要】：细胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP),主要存在于肝微粒体中,在外源性化合物的生物转化中起着十分重要的作用,参与临床上约80%常用药物的代谢。CYP酶系主要有CYP1、CYP2和CYP3三个家族,相比而言,比较重要的包括以下10种CYP亚型:CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4和CYP3A5。CYP催化反应是体内药物代谢的关键步骤,而影响药物在体内的药动学变化的根本原因是参与代谢的CYP酶的含量和活性存在较大个体差异。随着蛋白定量技术的迅速发展,稳定同位素稀释内标-多反应监测-质谱技术(SID-MRM-MS)因其特有的重现性和准确性已成为较理想的蛋白定量方法。然而,目前对CYP含量和活性的研究仅限于其在肝微粒体中的含量及活性。尽管肝微粒体作为一种传统的研究CYP酶的体系被广泛沿用,但是为了客观反映肝脏的真实状态,准确地预测体内的实际情况,有必要对肝脏从微观到宏观多水平的生理参数进行分析和讨论。因此确定10种CYP亚型在微粒体、肝组织、肝脏中的含量以及在酶水平、微粒体水平、肝组织水平和肝脏水平的活性,并研究同一水平10种CYP亚型的含量与活性的相关性,不同水平同种CYP亚型的含量间及活性间的相关性,以期为临床上个体化合理用药提供重要的生理值参考。方法1肝脏标本收集正常人肝标本90例,男性34例,女性56例,年龄在20~75岁之间,饮酒12例,抽烟12例。2人肝微粒体蛋白浓度的测定采用低温差速离心法制备人肝微粒体,Bradford法测定人肝微粒体蛋白浓度。3微粒体中CYP含量与活性的测定稳定同位素稀释内标-多反应监测-质谱技术测定人肝微粒体中10种CYP的含量,选用10种CYP的体外探针药物测定其相应的酶活性。4酶水平CYP活性的测定酶水平CYP的活性=微粒体水平CYP的活性/微粒体中CYP亚型的含量5肝组织水平CYP含量与活性的测定肝组织中CYP含量=微粒体中CYP含量×每克肝脏中微粒体蛋白含量(MPPGL)肝组织中CYP活性=微粒体中CYP活性×MPPGL6肝脏水平CYP含量与活性的预测肝脏中CYP含量=肝组织中CYP含量×肝重比(LW/BW)肝脏中CYP活性=肝组织中CYP活性×(LW/BW)7统计学方法采用SPSS 21.0软件对所有数据进行统计学分析,用GraphPad Prism 5.0作图软件作图。因本实验所得数据大部分不符合正态分布,故采用非参数检验分析,检验水准α为0.05。结果1正常人肝中10种CYP的蛋白含量90例正常人肝标本中10种CYP的蛋白含量符合非正态分布。在微粒体中,CYP2E1的蛋白含量最高,中位数为101.84 pmol/mg protein,范围为11.49-166.20pmol/mg protein。含量最低的为CYP2B6,中位数为4.54 pmol/mg protein,范围为1.68-46.19 pmol/mg protein。在肝组织中,CYP2C9的蛋白含量最高,中位数为3.67 nmol/g liver,范围为0.41-21.72 nmol/g liver。含量最低的为CYP2B6,中位数为0.21 nmol/g liver,范围为0.04-2.89 nmol/g liver。与肝组织中类似,在肝脏中,CYP2C9的蛋白含量最高,中位数为77.85 nmol/kg,范围为9.37-440.88nmol/kg。含量最低的为CYP2B6,中位数为4.75 nmol/kg,范围为0.75-60.49nmol/kg。2正常人肝中10种CYP的活性90例正常人肝标本中10种CYP的K_m、V_(max)和CL_(int)均符合非正态分布。10种CYP亚型的K_m个体差异较小,均在40倍以下。10种CYP的V_(max)在酶水平、微粒体水平、肝组织水平和肝脏水平的变化各有不同。除CYP1A2、CYP2A6和CYP2C8随着研究体系的扩大个体差异程度呈上升趋势以外,其他CYP的个体差异程度从酶水平到微粒体水平均先减小,而后又增大,并且肝组织水平和肝脏水平的结果相近。与V_(max)类似,10种CYP的CL_(int)在酶水平、微粒体水平、肝组织水平和肝脏水平的变化也不尽相同。随着研究体系的扩大,CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4、CYP3A5的个体差异程度先减小后增大;CYP2A6与CYP2D6的个体差异程度先增大后减小;CYP2C8与CYP2C19的个体差异程度一直增大,且肝组织水平和肝脏水平接近。3 10种CYP含量与活性的相关性基于微粒体水平、肝组织水平和肝脏水平分别对10种CYP的含量及其对应的活性进行相关性统计分析。3.1微粒体水平CYP1A2的蛋白含量与其K_m无相关性(P0.05),但与其V_(max)和CL_(int)具有显著相关性(P0.05)。CYP2D6的蛋白含量与其K_m呈负相关(P0.05),与其对应的CL_(int)呈弱相关,但与其对应的V_(max)无相关性。CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4的蛋白含量与其对应的微粒体水平活性均无相关性。其余CYP的含量与其活性均有不同程度的相关性。3.2肝组织水平除CYP2B6以外,其他酶亚型的蛋白含量和其对应的活性均有显著相关性(P0.05)。并且CYP1A2和CYP2E1的含量和其对应的V_(max)和CL_(int)有较强的相关性(r0.60,P0.05)。CYP2C19、CYP3A4和CYP3A5的含量和其对应的V_(max)和CL_(int)有较弱的相关性(0.50r0.60,P0.05)。CYP2D6的蛋白含量和CYP2D6的V_(max)和CL_(int)呈弱相关(0.40r0.60,P0.05)。3.3肝脏水平除CYP2B6以外,其他各酶亚型的蛋白含量与其对应的V_(max)和CL_(int)均有显著相关性(P0.05)。CYP1A2和CYP2E1的蛋白含量与其对应的活性具有较强的相关性(r0.60,P0.05)。CYP2C19、CYP3A4和CYP3A5的蛋白含量与其对应的V_(max)和CL_(int)相关性较弱(0.50r0.60,P0.05)。4 10种CYP蛋白含量的相关性4.1微粒体水平CYP1A2的蛋白含量与CYP2B6、CYP2C19的蛋白含量均无相关性(P0.05),与其他酶蛋白含量有显著相关性(P0.01)。CYP2B6的蛋白含量与其他任何酶蛋白含量之间均无相关性。CYP2D6的蛋白含量除与CYP2B6的蛋白含量无相关性外,与其他酶含量都有显著相关性(P0.01)。CYP3A5的蛋白含量与CYP2B6、CYP2C19的蛋白含量无相关性,与其他酶含量都有显著相关性。4.2肝组织水平CYP1A2的蛋白含量与其他所有酶的蛋白含量均有显著相关性(P0.05),并且与CYP2C8、CYP2C9、CYP2E1的蛋白含量的相关性较强(P0.01)。CYP2C9的蛋白含量与其他所有酶的蛋白含量均有显著相关性,并且与CYP1A2、CYP2C8、CYP2E1的蛋白含量的相关性较强(P0.01)。除CYP2C19的蛋白含量与CYP3A5的蛋白含量无相关性(P0.05)外,CYP2E1、CYP3A5的蛋白含量均与其他所有CYP的蛋白含量有显著相关性。4.3肝脏水平除了CYP2B6的蛋白含量与CYP2C19、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C19的蛋白含量无相关性(P0.05)以外,其他酶含量均有显著相关性(P0.01)。4.4微粒体水平、肝组织水平与肝脏水平Spearman相关性分析分析90例正常人肝10种CYP的蛋白含量在微粒体水平、肝组织水平与肝脏水平之间的相关性。发现同一种CYP亚型蛋白含量在微粒体水平、肝组织水平、肝脏水平之间均有显著相关性(P0.05)。5 10种CYP活性的相关性5.1酶水平CYP1A2的V_(max)与CYP2B6、CYP2C19、CYP3A4的V_(max)无相关性(P0.05),与其他CYP的V_(max)均有显著相关性(P0.05)。CYP2C8的V_(max)与CYP2C19的V_(max)无相关性,与其他CYP的V_(max)均有显著相关性。CYP2C19的V_(max)只与CYP2A6有相关性。CYP3A5的V_(max)与CYP3A4的V_(max)的相关性最强。CYP2C19的CL_(int)与CYP2C9的CL_(int)有显著相关性(P0.05),与其他酶的CL_(int)均无相关性(P0.05)。CYP2D6、CYP2E1的CL_(int)除与CYP2C19的CL_(int)无相关性外,与其他酶的CL_(int)均有显著相关性。5.2微粒体水平CYP2A6的V_(max)只与CYP2C19的V_(max)有显著相关性(P0.05),与其他CYP的V_(max)均无相关性(P0.05)。CYPC8的V_(max)与CYP2A6、CYP2E1的V_(max)无相关性,与其他CYP的V_(max)有较强相关性(P0.01)。CYP2E1的V_(max)与CYP2C9、CYP2C19的V_(max)有显著相关性。CYP2A6的CL_(int)与其他所有CYP的CL_(int)无相关性(P0.05)。CYP2D6的CL_(int)只与CYP2B6的CL_(int)有相关性(P0.05)。CYP2C19的CL_(int)只与CYP3A4的CL_(int)有显著相关性(P0.01)。CYP2E1的CL_(int)只与CYP1A2、CYP2C19的CL_(int)有相关性。5.3肝组织水平CYP2B6的V_(max)只与CYP2A6的V_(max)无相关性(P0.05),与其他CYP的V_(max)均有显著相关性(P0.05)。CYP2D6的V_(max)与CYP2A6的V_(max)无相关性,与其他CYP呈弱相关。10种CYP的CL_(int)均有显著相关性。5.4肝脏水平CYP2A6的V_(max)与CYP2B6、CYP2D6的V_(max)无相关性(P0.05),其余各酶之间V_(max)均有显著相关性(P0.05)。CYP2C9的V_(max)与CYP2E1的V_(max)有较强相关性。10种CYP的CL_(int)均有显著相关性。5.5酶水平、微粒体水平、肝组织水平与肝脏水平Spearman相关性分析10种CYP的活性在酶水平、微粒体水平、肝组织水平与肝脏水平之间的相关性。在酶水平与微粒体水平之间,除CYP2C19与CYP3A5的V_(max)在两个水平之间无相关性外(P0.05),其他CYP的V_(max)在两个水平之间均有相关性(P0.05)。除CYP2A6与CYP2C19的CL_(int)在两个水平之间无相关性外,其他CYP的CL_(int)在两个水平之间均有相关性。在酶水平与肝组织水平之间,除CYP2C9、CYP2C19与CYP3A5的V_(max)在两个水平之间无相关性外(P0.05),其他CYP的V_(max)在两个水平之间均有相关性(P0.05)。除CYP2A6、CYP2C19与CYP3A5的CL_(int)在两个水平之间无相关性外,其他CYP的CL_(int)在两个水平之间均有相关性。在酶水平与肝脏水平之间,除CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19与CYP3A5的V_(max)在两个水平之间无相关性外(P0.05),其他CYP的V_(max)在两个水平之间均有相关性(P0.05)。除CYP2A6与CYP2C19的CL_(int)在两个水平之间无相关性外,其他CYP的CL_(int)在两个水平之间均有相关性。在微粒体水平与肝组织水平之间以及微粒体水平与肝脏水平之间,所有CYP的V_(max)和CL_(int)在两个水平之间均有显著相关性(P0.05)。在肝组织水平与肝脏水平之间,所有CYP的V_(max)和CL_(int)在两个水平之间均有很强的相关性(r0.90,P0.05)。结论1.首次提供了正常人肝10种CYP在微粒体水平、肝组织水平和肝脏水平蛋白含量的生理值,各水平均有显著的个体差异。2.在微粒体水平,CYP2A6的蛋白含量对其活性的影响较明显;但在任一水平,CYP2B6的蛋白含量对其活性均无影响。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R341

【参考文献】

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1 ;CYP2E1 Pst Ⅰ/Rsa Ⅰ polymorphism and colorectal cancer risk:A meta-analysis[J];World Journal of Gastroenterology;2010年23期

本文编号：2822784