Sirt1介导RNA结合蛋白QKI的去乙酰化在饥饿肝脏能量平衡中的作用

发布时间：2020-09-24 04:44

　　肝脏在饥饿状态下的能量平衡调节中发挥了关键作用。饥饿早期，肝脏糖原迅速分解，维持正常的血糖浓度，同时，肝脏的糖异生也开始启动，一些非糖物质经肝脏转化后生成葡萄糖，入血后维持血糖浓度和提供能量。随着饥饿时间的延长，脂肪组织分解，提供甘油和脂肪酸。甘油可以作为糖异生的原料，而脂肪酸能被进一步氧化，为全身能量供应提供支持。肝脏在进行脂肪酸氧化过程中生成酮体，酮体入血后运送到全身多个组织器官为细胞提供能量。因此，肝脏在饥饿的能量平衡中发挥了核心作用，而这些能量平衡调控的深层次机制涉及到多种错综复杂的分子信号。换句话说，饥饿状态下，糖原分解、糖异生、脂肪酸氧化、酮体生成等供能效应，其本质是细胞分子信号通路在饥饿环境下的适应性调控过程。许多病理条件下，如糖尿病、脂肪肝等疾病，肝脏能量平衡相关信号转导发生障碍，异常的分子调控导致了疾病的发生、发展。为此，深入研究肝脏代谢分子机制，可以丰富分子代谢理论，同时，为疾病的诊治提供新的思路。为适应环境变化，信号分子在表观遗传、转录、转录后、翻译、翻译后等水平的多重调节下发生自身表达和活性的改变，以便适应环境变化。饥饿时，肝脏中NAD依赖的蛋白去乙酰化酶Sirt1通过翻译后修饰（去乙酰化）促进PGC1α、FOXO1等代谢相关转录因子/转录共调节因子的活性，而活化的转录因子/转录共调节因子通过转录调节机制增加下游代谢相关酶的表达，促进长期饥饿下肝脏的糖异生和脂肪酸氧化，调节血糖的平衡和能量供应。可见，饥饿环境下，肝脏细胞中的代谢相关信号分子受到了不同层面的多重调控。 RNA结合蛋白介导的转录后调控在肝脏代谢中少有研究。STAR家族成员QKI（Quaking）是一个RNA结合蛋白，由qkI基因编码，可产生多个异构体，在全身多种组织细胞中表达。其中，QKI5主要定位于胞核，但也能穿梭到胞浆，而QKI6和QKI7主要分布在胞浆中。通过与mRNA的3UTR的特异性识别元件（QRE）结合，QKI在调节mRNA的胞浆/胞核定位、稳定性、翻译效率等方面发挥了关键作用。在神经系统，QKI能增加MBP的表达，从而增加髓鞘的形成。在结肠癌中，QKI通过影响β-catenin的亚细胞定位，发挥抑癌基因效应。我们发现，QKI同样在肝脏表达，而有关其在肝脏中的功能尚没有研究报道。【目的】（1）在体内和体外模型中，查看QKI在肝脏饥饿能量平衡过程中的表达变化，分析QKI与糖异生、脂肪酸氧化和酮体生成的相关性；（2）在体内和体外模型中，探讨QKI是否受乙酰化修饰调节，并阐明QKI的乙酰化修饰在饥饿肝脏能量代谢中的作用；（3）分析QKI乙酰化修饰的上游调节分子机制，探讨上游调节分子如何影响QKI，并在饥饿肝脏代谢中发挥效应；（4）分析受乙酰化修饰调节的QKI通过调节哪些下游关键分子，从而影响肝脏饥饿能量代谢，并进一步阐明QKI调节下游分子的深层次机制。【方法和结果】（1）在小鼠饥饿的肝脏组织、低糖和Forskolin/dexamethasone处理的HepG2细胞中，利用免疫组化、qRT-PCR和Western-blot检测QKI的表达变化。结果发现，肝脏中，QKI5是主要表达的异构体。与对照相比，QKI5的表达呈现升高的趋势。（2）在上述饥饿模型中，使用乙酰化抗体进行免疫共沉淀（IP），Western-blot检测QKI5乙酰化水平；利用生物信息学技术预测QKI5可能的乙酰化修饰位点；构建乙酰化位点突变的QKI5表达载体，探讨乙酰化修饰的改变对饥饿肝脏能量代谢的影响。结果表明，QKI5在饥饿的肝脏中表现为去乙酰化状态，而使用突变载体干预发现，QKI5的KH domain区赖氨酸突变为精氨酸（MTR5，乙酰化位点缺失）时，促进肝脏糖异生、脂肪酸氧化和酮体生成；突变为谷氨酰胺（MTQ5，相当于乙酰化的氨基酸），则抑制糖异生、脂肪酸氧化和酮体生成。（3）使用去乙酰化酶Sirt1的抑制剂和激活剂，IP试验检测肝脏细胞QKI5的乙酰化水平；在细胞中干涉Sirt1的表达，检测QKI5的乙酰化水平；在Sirt1敲除的小鼠肝脏中查看QKI5的乙酰化水平。结果表明，在肝细胞中抑制Sirt1的活性，QKI5乙酰化水平增加，促进Sirt1活化，则导致QKI5去乙酰化；在干涉Sirt1表达的肝细胞和Sirt1基因敲除的小鼠肝脏组织中，QKI的乙酰化水平都是升高的。（4）在肝脏细胞中干涉QKI5、过表达QKI5、MTR5、MTQ5，结合饥饿模型刺激，qRT-PCR检测肝脏代谢相关的关键分子的表达。结果发现，干涉QKI5或过表达MTQ5能抑制FOXO1和PPARα表达，而过表达QKI5或MTR5则促进FOXO1和PPARα表达。通过RNA-IP实验发现，QKI5与FOXO1和PPARα的mRNA有相互作用。（5）通过报告系统实验进一步验证QKI5、MTR5和MTQ5对FOXO1和PPARα的转录后调节机制。结果表明，过表达QKI5和MTR5能增加FOXO1和PPARα报告基因的萤光素酶活性，而过表达MTQ5则抑制其活性。【结论】 RNA结合蛋白QKI在饥饿肝脏能量代谢中发挥了重要作用。饥饿时，肝脏Sirt1促进了QKI的去乙酰化，去乙酰化的QKI通过转录后调节机制促进转录因子FOXO1和PPARα的表达，进而促进糖异生、脂肪酸氧化及酮体生成，从而在肝脏能量平衡中发挥作用。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R333.4

【共引文献】