脊髓腹角神经元单细胞膜片钳技术建立及相关受体分析

发布时间：2020-09-24 07:31

　　目的:建立新生大鼠脊髓腹角神经元急性分离方法及单细胞膜片钳记录技术,以深入研究脊髓腹角神经元上各受体的分布、分型和作用机制,为揭开脊髓的运动调制奠定基础,为运动神经元疾病的治疗提供思路。方法:选用鼠龄7-12 d的新生SD大鼠,麻醉后手术分离出含腰骶膨大的脊髓,修剪神经根后,制备400-500μm厚的横切片,置于人工脑脊液中孵育1小时;后在消化酶溶液中恒温消化20-35 mins,取出后沿中央管切除双侧背角,将剩余腹角的部分移至含标准细胞外液的培养皿中,用自制的玻璃吹管机械吹打,直至分离出单细胞,静置贴壁后,进行膜片钳电生理记录。通过快速给药系统给予工具药,记录细胞产生的电流变化,并可以通过成像系统采集单个神经细胞图像。结果:(1)分离的神经元胞体较大,呈纺锤形、三角锥形或多角形,边缘光整;神经元的突起从极端发出,形态较为完整,具有分支。(2)分离的脊髓腹角神经元基本电生理参数为:静息电位-65.34±13.63 m V,阈电位-46.11±8.96 m V,锋电位幅值54.51±15.17 m V,超射8.39±7.70 m V,放电频率19.93±9.22 Hz。(n=14)(3)谷氨酸诱发电流具有浓度依赖性,EC50=0.24 m M;平均翻转电位为17.63±10.04 m V。(4)尼古丁诱发电流具有浓度依赖性,EC50=0.08 m M;平均翻转电位为29.06±14.88 m V。(5)记录到的谷氨酸诱发电流达峰时间较短,受体激活较快,失敏较慢;而尼古丁受体激活较慢,失敏较快。平均上升斜率、达峰时间、平均下降斜率、失敏时间,均有显著性差异(p0.05)。(6)6个神经元给予α7-n ACh R选择性阻断剂MLA时,尼古丁诱发电流并没有产生显著性变化。6个神经元给予α4β2-n ACh R选择性阻断剂DHβE时,其中有2个细胞尼古丁电流幅度减弱45%;而其它4个神经元,尼古丁电流没有被压抑,并且同时给予MLA时,均未被压抑或阻断。结论:按照所建立的脊髓腹角神经元急性分离方法得到的神经细胞形态良好,该急性分离方法切实可行。急性分离的脊髓腹角神经元可记录到稳定而连续的自发动作电位,神经元可记录到谷氨酸和尼古丁诱发的全细胞电流以及浓度依赖性反应,并可测得其翻转电位。部分神经元的尼古丁诱发电流可被DHβE压抑;大部分神经元的尼古丁诱发电流对DHβE和MLA均不敏感。我们所急性分离的脊髓腹角神经元上诱发的尼古丁电流,部分由α4β2-n ACh R介导;而另一部分,可能由非α4β2-非α7-n ACh R介导。
【学位单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R338
【部分图文】：

实验流程

图 1. 实验流程。（A）实验动物：选用 7-12 天新生乳大鼠；（B）取出腰骶段脊髓置于震荡切片机中切片；（C）切片置于消化酶溶液中恒温消化；（D）在标准细胞外液中用自制的玻璃吹管机械吹打切片腹角部分；（E）急性分离的脊髓腹角神经元置于膜片钳实验台上进行记录（左侧为给药管；右侧为记录电极）。Fig 1. Experimental procedure. (A) Experimental animals: neonatal SD rats aged 7-12 daysold; (B) The lumbosacral spinal cord was removed and sliced by slicer. (C) The slices weredigested in the enzyme solution with constant temperature; (D) Ventral horn neurons weremechanically dissociated by gently triturating with fire-polished Pasteur pipettes in standardsolution; (E) The acutely isolated ventral horn neurons were recorded on the patch-clampexperiment table (Drug tubes on the left; Recording electrode on the right).2.2 酶消化处理及机械分离细胞孵育完成后，将 3-4 片脊髓切片移入预通混合氧的含酶溶液（Papain，0.18g/30 ml ACSF）的小烧杯中，置于恒温水浴箱内 33℃ 消化 20-35 min（图 1C），

框标,红色,模式

19实验所采用的给药模式（protocol）的设置。红色框标注为 3000 ms 冲洗-20000 ms 冲洗的模式。 The setting of drug delivery protocol for the experiment. The red frame is mas flushing -2000 ms drug delivery -3000 ms flushing mode.

示意图,示意图,电位,两独

之后用Clampfit 10.6以及Origin 5.0软件对实验数据进行采集软件LAS V3.8拍摄和处理神经元的形态照片，选取具有片进行作图；分析电流-电压（I-V）关系时，选取具有代表细胞静息电位时的电流幅度作为标准，对其他不同钳制电位归一化处理，作出散点图，绘制I-V拟合的趋势线，根据公式的翻转电位。所有的实验样本数据皆以均数±标准差（ x ± 细胞电流幅度皆为峰电流幅度（图 3），而非稳态电流幅度的电流反应统计分析采用两独立样本t检验，p<0.05时，差。

【参考文献】