LZ8-Fc融合蛋白重组表达及其稳定性研究

发布时间：2020-09-24 10:23

　　灵芝自古便是中国传统医学中的珍贵药材，被认为具有滋补强身、扶正固本之效。近代科学研究也证实灵芝的粗提物具有抗肿瘤和增强免疫力之功能，然而多数研究认为灵芝主要活性成分为多醣体及三萜类化合物，直至1989年Kino等科学家自灵芝的菌丝体纯化出具有免疫调节功能的小分子蛋白质—灵芝免疫调节蛋白（LZ-8），确立另一种活性物质免疫调节蛋白的存在。二十多年以来，国内外数十家课题组对其进行了深入研究，利用多种基因工程表达系统获得了重组LZ-8，揭示了LZ-8的晶体结构和主要理化性质，最为重要的是发现了LZ-8具有多种达到临床治疗价值的免疫调节和抗肿瘤活性。虽然LZ-8具有药用价值，但其被开发成为新药仍不被看好，主要原因是分子量小，仅13kDa，极容易被机体代谢，体内稳定性差，难以发挥其生物学作用。此外，LZ-8来源于灵芝，属于异源蛋白，易引起机体免疫系统产生严重的排异反应。考虑到以上问题，在本研究中将LZ-8与人IgG Fc段融合（LZ8-Fc）在毕赤酵母中进行重组表达，建立了中试发酵和纯化工艺，初步研究了LZ8-Fc的体内稳定性和LZ-8的融合表达策略，本论文的实验数据为融合蛋白表达共性问题中的不稳定性因素提供了理论基础，将对其长效剂型的开发具有一定的参考意义。本研究中使用GGSS柔性肽段连接rLZ8和人IgG1中的Fc段，根据毕赤酵母密码子偏好性重新设计基因序列，两端设EcoRI（GAATTC）和KpnI（GGTACC）酶切位点，进行全基因合成。将目的基因片段连接至AOX1型启动子的甲醇诱导分泌型表达载体—pPICZɑ A，重组后的质粒命名为pPICZɑ A-LZ8-Fc。重组质粒电转化入毕赤酵母菌株X33，在摇瓶规模进行转化克隆的表达筛选，并初步优化了甲醇诱导表达条件。在40升中试发酵规模下，通过摸索发酵过程工艺参数，包括pH值、DO值、罐压、温度、通气量，优化LZ8-Fc重组蛋白的甲醇诱导发酵工艺；发酵液上清SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定结果均显示，从甲醇诱导表达阶段，开始有目的蛋白条带，至发酵后期出现了降解的LZ-8蛋白条带。LZ8-Fc融合蛋白发酵上清经过两步切向流过滤处理，将样品经MabSelect Sure亲和层析和Superdex75凝胶过滤层析进行纯化，确定其稳定的纯化工艺，获得了纯度较高的LZ8-Fc融合蛋白，电泳显示为单一条带，质谱分析结果与预期一致。但是Western Blot结果表明LZ8-Fc融合蛋白在纯化过程中发生了降解。经检测，LZ8-Fc融合蛋白浓度为248g/mL，高效液相色谱的分子筛鉴定，LZ8-Fc融合蛋白的纯度为98.33%。采用绵羊血红细胞凝集实验鉴定发现与相同摩尔质量的LZ-8蛋白比较，LZ8-Fc凝血活性降低。小鼠脾细胞的γ干扰素活性实验显示，LZ8-Fc未表现出LZ-8刺激脾细胞产生γ-干扰素的免疫调节活性。半衰期检测采用大鼠尾静脉给药的方法，按照5min，30min，1h，2h，4h，8h，24h，48h八个时间点取血，结果表明血清中LZ8在8h内明显下降，24h后超出检测范围，LZ8-Fc融合蛋白在4h后超出检测范围。根据SCOP网站的数据库中的信息表明，LZ-8和IgG Fc段的晶体结构均为球蛋白，因而我们利用分子筛为原理的HPLC分析LZ8-Fc在自然状态下的保留时间，进而推断出LZ8-Fc的分子组装方式，实验结果显示LZ8-Fc仍以二聚体形式进行组装的。本研究中还发现一个重要的实验现象，即将LZ8-Fc浓缩至浓度（2.5mg/mL）时，LZ8-Fc分子出现了断裂。本研究中采用分子动力学计算分析LZ8-Fc分子的稳定性，并结合圆二色光谱结构分析，发现融合表达后分子的二级结构出现了很大变化，这可能是影响LZ-8分子稳定性的主要原因。本研究为增强LZ-8的体内稳定性，降低其作为异源蛋白的免疫原性进行了初步探索。虽然LZ8-Fc分子仍不够稳定，但本论文的实验数据表明在融合蛋白表达后的应用中普遍存在的一个重要的问题，即位于N末端的蛋白可能会影响下游蛋白质的正确折叠。因此，融合表达中应尽量保留下游蛋白原有的N末端，为其他在融合蛋白表达的设计上提供了理论依据。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R3411;R283.6
【部分图文】：

noderma lucidum）自古以来为我国吉祥如意的象征（图壮、扶正固本的名贵药材，其为中医所用已有 2000 年之分丰富，我国古代早就对灵芝的药用价值有所认识，根据农本草经》的记载，灵芝被列为“上品”，系指养生之药且无副作用。近年来有文献报道从灵芝中分离了一些蛋，并对它们的功能进行了研究。如免疫调节、抗肿瘤、降作用等[1-5]。真菌免疫调节蛋白（Fungal Immunomodulato灵芝中获得的一种低分子蛋白质，它们的功能与结构在其它高等担子菌中相继发现了几种类似的蛋白质，共质家族—FIPs[6]。FIPs 具有广泛的免疫调节特性，如促胞凋亡，调控细胞周期，影响细胞因子的表达及活化粘物研究开发潜力。

进化树,松杉灵芝,赤灵芝,蛋白

疫调节蛋白（Lingzhi-8, LZ-8），由于该蛋白具有多种免疫十多年以来一直是本领域研究的热点，是 FIPs 蛋白家族近年从高等担子菌（蘑菇类）子实体中提取，与免疫球蛋的一类小分子蛋白质[8]。目前已经从赤灵芝（Ganodermanoderma japoncium）[9]，松杉灵芝（Ganoderma tsugae）derma microsporum）[11]，金针菇（Flammulina velutipa volvacea）[12,13]分离提取了 7 种 FIPs 蛋白，分别命名为 Li，FIP-fve，FIP-vvo 和 FIP-vvl。这 7 种 FIPs 蛋白由 11，不含组氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（M（Asp）和缬氨酸（Val），其 N 端氨基酸均为乙酰化阻断具有较高同源性（图 1.1.2），约为 57%-100%[14,15]，它们，来源于赤灵芝的 LZ-8 和松杉灵芝的 FIP-gts 其氨基酸序

氨基酸组成,二级结构,基因序列

1.2 LZ-8 的特征Tanaka 等采用两相色谱系统、凝胶过滤及离子交换方法对 LZ-8 进行了纯化，蛋白质测序显示 LZ-8 由 110 个氨基酸残基组成，具有 2 个 α 螺旋、7 个 β-折叠和 1 个 β-转角，氨基端乙酰化。分子量为 12.4kD ，等电点为 4.4[8]。1991 年，Tanaka 等采用混合寡核苷酸探针技术，从灵芝菌丝体 cDNA 文库中克隆了 LZ-8核苷酸序列，证实了由该核苷酸编码序列推导的氨基酸序列与所获 LZ-8 氨基酸序列。（图 1.1.3）LZ-8 基因由 524 bp DNA 组成，基因组序列上游转录起始区含有 1 个 TATA-box 和 2 个 CCAAT 样序列。其 5’端非转译区含有 1 个 61bp 的内含子，把该基因分成 2 个外显子[9]。

【参考文献】