甲型流感病毒与宿主细胞相互作用的动态蛋白质组学研究

发布时间：2017-04-03 00:02

  本文关键词：甲型流感病毒与宿主细胞相互作用的动态蛋白质组学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：甲型流感病毒(Influenza A virus)是单股负链RNA病毒,可通过呼吸道感染造成人类及动物流行性感冒,对人类健康造成严重威胁。甲型流感病毒入侵宿主细胞并在其中进行复制、繁殖等过程由于多种宿主细胞蛋白和病毒蛋白的参与而变得错综复杂。而且流感病毒与宿主相互作用机制仍有许多未知,加之流感病毒易发生变异,更加增大流感病毒药物的研发及人类疾病防控的难度。因而寻找高效精确的研究方法是完善病毒与宿主互作机制及加速病毒药物研发的重中之重。首先我们选用流感病毒H7N9毒株的NP蛋白作为研究对象,采用免疫共沉淀及质谱鉴定的方法富集并检测与NP蛋白相互作用的宿主蛋白,通过大量数据分析发现132个相关蛋白,其中有17种蛋白涉及剪切体细胞信号通路,推断H7N9流感病毒的NP蛋白可能参与宿主细胞应对病毒感染所引起的剪切体通路应答。然而,免疫共沉淀的方法对于实现高通量的研究目标具有很大难度,所以我们还采用了另一种方法对流感病毒与宿主相互作用进行研究,即将化学生物学的概念和研究策略与蛋白质组学分析技术相结合,利用特异性的化学分子探针通过生物正交反应对H1N1感染宿主后不同时间点的新生成蛋白进行富集及质谱鉴定。从而对流感病毒H1N1侵染宿主细胞过程所引起的蛋白质组的微小变化进行表征,在一定程度上实现了高通量、高精确性的研究目标。通过大量质谱数据分析发现了2859个宿主蛋白在H1N1感染过程中表达水平存在变化。为后续甲型流感病毒与宿主相互作用的研究提供大量数据及新方法。本研究将对于完善流感病毒逃避免疫监视并形成持续感染或对机体造成损害的分子机制,发现新的治疗靶点及防治途径具有非常重要的意义。
【关键词】：蛋白质组 生物正交反应 甲型流感病毒 相互作用 新生成蛋白
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373.13
【目录】：

• 前言4-6
• 中文摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文缩写词表12-13
• 第一章 绪论13-23
• 1.1 甲型流感病毒及与宿主相互作用的研究进展13-16
• 1.1.1 流感病毒的主要蛋白13-15
• 1.1.2 目前流感病毒与宿主相互作用的研究进展15-16
• 1.2 蛋白质组学及其在流感病毒研究中的进展16-18
• 1.2.1 蛋白质组学概述16-17
• 1.2.2 蛋白质组学在流感病毒研究中的应用及其局限性17-18
• 1.3 生物正交反应概述及应用18-23
• 1.3.1 生物正交反应的特点18-20
• 1.3.2 生物正交反应的应用20-23
• 第二章 H7N9 NP蛋白与宿主相互作用的蛋白质组学研究23-37
• 2.1 实验材料23
• 2.2 实验方法23-27
• 2.2.1 H7N9 NP质粒构建、扩增23-24
• 2.2.2 293T细胞培养24
• 2.2.3 pCMV-NP质粒转染 293T细胞24
• 2.2.4 免疫共沉淀24-25
• 2.2.5 SDS-PAGE电泳与免疫印迹25-26
• 2.2.6 缓冲液替换及胰蛋白酶裂解26
• 2.2.7 Nano-LC-MS/MS质谱检测及数据检索26-27
• 2.2.8 生物信息学分析及Western Blot实验验证27
• 2.3 实验结果与讨论27-35
• 2.3.1 NP蛋白表达及免疫共沉淀27-29
• 2.3.2 质谱鉴定与NP蛋白相互作用的宿主蛋白29-30
• 2.3.3 宿主蛋白赖氨酸乙酰化修饰30-32
• 2.3.4 生物信息学分析及结果验证32-35
• 2.4 小结35-37
• 第三章 生物正交反应及检测方法的建立37-48
• 3.1 实验材料37
• 3.2 实验方法37-42
• 3.2.1 293T细胞的培养37-38
• 3.2.2 细胞影像学分析方法的建立（细胞水平标记）38-39
• 3.2.3 蛋白水平标记方法的建立39-40
• 3.2.4 新生成蛋白ELISA检测方法的建立40-41
• 3.2.5 新生成蛋白免疫印迹检测方法的建立41
• 3.2.6 新生成蛋白质谱检测方法的建立41-42
• 3.3 实验结果与讨论42-47
• 3.3.1 细胞影像学分析方法建立结果42-43
• 3.3.2 蛋白水平生物正交反应标记荧光分子43-44
• 3.3.3 新生成蛋白ELISA检测方法的建立结果44
• 3.3.4 新生成蛋白免疫印迹检测方法的建立结果44-45
• 3.3.5 PD-10 除盐柱富集条件探索结果45
• 3.3.6 亲和纯化方法条件确立结果45-46
• 3.3.7 新生成蛋白质谱检测结果46-47
• 3.4 小结47-48
• 第四章 流感病毒感染及非天然氨基酸标记条件优化48-56
• 4.1 实验材料48
• 4.2 实验方法48-50
• 4.2.1 甲型流感病毒H1N1扩增48
• 4.2.2 血球凝集(HA)试验与TCID_(50)测定48-49
• 4.2.3 非天然氨基酸AHA处理Vero细胞时间的确定49-50
• 4.3 实验结果与讨论50-55
• 4.3.1 流感病毒H1N1感染剂量确定50-51
• 4.3.2 细胞水平观察AHA处理Vero不同时间新生蛋白情况51-52
• 4.3.3 ELISA检测AHA处理Vero细胞不同时间新生蛋白情况52-54
• 4.3.4 质谱检测结果54-55
• 4.4 小结55-56
• 第五章 H1N1感染Vero细胞及新生成蛋白的检测与分析56-67
• 5.1 实验材料56
• 5.2 实验方法56-58
• 5.2.1 H1N1感染Vero细胞显微成像56-57
• 5.2.2 H1N1感染Vero细胞获得新生成蛋白质组及检测分析57-58
• 5.3 实验结果与讨论58-66
• 5.3.1 H1N1感染Vero细胞系显微成像结果58-59
• 5.3.2 ELISA检测H1N1感染Vero不同时间后新生成蛋白的变化59
• 5.3.3 免疫印迹方法检测部分时间点新生成蛋白情况59-60
• 5.3.4 蛋白质组学分析结果60-66
• 5.4 小结66-67
• 第六章 结论67-68
• 参考文献68-75
• 附录75-90
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果90-91
• 致谢91

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;科学家揭示甲型流感病毒起源[J];中国科技信息;2009年13期

2 辛潇;吴怡;;甲型流感病毒的研究进展[J];沈阳医学院学报;2011年02期

3 郭元吉;范瑞莲;曲凤珍;王敏;朱既明;;甲型流感病毒在我国动物中分布的初步调查[J];微生物学报;1981年03期

4 郭元吉;甲型流感病毒在我国动物中分布的初步调查[J];中国医学科学院学报;1981年04期

5 ;甲型流感病毒能更深入侵害肺细胞[J];山东中医药大学学报;2009年06期

6 张钫;张舒;;甲型流感病毒的变异及其跨物种传播[J];国外医药(抗生素分册);2010年02期

7 ;新研究揭示甲型流感病毒变异后更致命原因[J];现代科学仪器;2010年05期

8 ;科学家分离出中和甲型流感病毒的超级抗体[J];上海预防医学;2011年08期

9 张宏;徐可;孙兵;;甲型流感病毒的跨种传播[J];科学;2012年04期

10 庄丽;付琳;任丽娟;郑勤妮;;贵州省2012年度甲型流感病毒组成情况分析[J];贵州医药;2013年02期

中国重要会议论文全文数据库 前9条

1 王萍;费军;张朝利;;甲型流感病毒肺炎的影像学特征分析[A];中华医学会第七届全国呼吸道感染学术大会暨第一届多学科抗感染治疗学术研讨会论文汇编[C];2011年

2 王萍;费军;张朝利;;甲型流感病毒肺炎的影像学特征分析[A];中华医学会呼吸病学年会——2011（第十二次全国呼吸病学学术会议）论文汇编[C];2011年

3 刘洪波;吴衍恒;朱远峰;梁洪;周日东;;两种病毒RNA提取试剂对甲型流感病毒的灭活效果研究[A];2012广东省预防医学会学术年会资料汇编[C];2013年

4 刘洪波;吴衍恒;朱远峰;梁洪;周日东;;两种病毒RNA提取试剂对甲型流感病毒的灭活效果研究[A];2011广东省预防医学会学术年会资料汇编[C];2011年

5 宋康;夏永良;骆仙芳;柴秀娟;;防感颗粒抑制甲型流感病毒作用的实验研究[A];中医药学术发展大会论文集[C];2005年

6 张湘燕;叶贤伟;冯端兴;韩婧;李丹;张程;;甲型流感病毒重症感染致嗜血细胞综合征1例报道[A];中华医学会第七届全国呼吸道感染学术大会暨第一届多学科抗感染治疗学术研讨会论文汇编[C];2011年

7 宋康;夏永良;柴秀娟;骆仙芳;;防感颗粒抑制甲型流感病毒作用的实验研究[A];2005年浙江省呼吸系病学术年会论文汇编[C];2005年

8 刘欣;李春梅;刘小冬;张铭;;一例重症甲型流感病毒(H3N2)感染的临床分析与护理[A];全国医院感染护理新进展研讨会、全国传染病护理新进展研讨会、全国自然灾害护理研讨会论文汇编[C];2011年

9 蒋利萍;解元元;李慧;李秋;方平;王莉佳;杨锡强;;脱氧核酶PB1-DZ抑制甲型流感病毒复制的体外研究[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者　曹丽君;科学家发现甲型流感病毒细胞内复制机制[N];新华每日电讯;2006年

2 ;世卫官员：甲型流感病毒相当稳定[N];新华每日电讯;2009年

3 凌朔;人和猪外,又发现火鸡感染甲型流感病毒[N];新华每日电讯;2009年

4 记者 黄X;甲型流感病毒疑对猪威胁更大[N];新华每日电讯;2009年

5 钟山;试验证明痰热清可直接抑制亚甲型流感病毒[N];健康报;2009年

6 记者 李天舒　通讯员 朱丹萍;可携带报告基因的甲型流感病毒“人造”成功[N];健康报;2011年

7 ;痰热清可直接抑制亚甲型流感病毒[N];中国中医药报;2009年

8 记者 李雪墨;植物MIR2911可直接靶向甲型流感病毒[N];中国医药报;2014年

9 文一山;痰热清可明显抑制亚甲型流感病毒[N];中国医药报;2007年

10 记者 刘国远;美英甲流耐药性病例均有免疫系统缺陷[N];新华每日电讯;2009年

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 仇超;接种2009年H1N1甲型流感疫苗对宿主抗异源流感病毒抗体免疫水平的影响[D];复旦大学;2014年

2 崔淑娟;甲型流感病毒亚型间血清学交叉反应特征研究及反向遗传系统的优化[D];北京协和医学院;2009年

3 吕进;甲型流感病毒（H1N1）感染介导的小鼠肺免疫损伤机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前9条

1 池晓娟;真核翻译起始因子eIF4B在甲型流感病毒复制中的作用[D];福建农林大学;2013年

2 孙宁宁;甲型流感病毒与宿主细胞相互作用的动态蛋白质组学研究[D];吉林大学;2016年

3 陈翠;甲型流感病毒的快速筛查和天龙复方制剂对甲型流感病毒作用的初步研究[D];广州医学院;2011年

4 麻粉莲;人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白的原核表达及纯化[D];西北农林科技大学;2009年

5 冯润;甲型流感病毒核蛋白基因真核质粒构建及表达[D];南昌大学;2010年

6 黄琳;甲型流感病毒M2质子通道质子传导机理的分子动力学模拟[D];上海交通大学;2013年

7 杨靖;甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及其免疫保护性的初步研究[D];四川大学;2006年

8 李超;甲型流感病毒二级结构分析及基于RNA三矢量曲线表示的多尺度比较的WEB实现[D];吉林大学;2013年

9 王鼎;甲型流感病毒表面血凝素（HA）与神经氨酸酶（NA）之间的相互作用[D];暨南大学;2011年

  本文关键词：甲型流感病毒与宿主细胞相互作用的动态蛋白质组学研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：283350