结核分枝杆菌新型疫苗的构建及免疫学评价

发布时间：2020-10-23 10:14

　　 结核病是世界上严重威胁人类健康的传染病。世界卫生组织(WHO)统计结果表明,2016年新增结核病患者约1040万,并且有170万人因结核病而死亡。卡介苗(BCG)是目前世界范围内唯一使用的抗结核疫苗。虽然BCG控制儿童结核病十分有效,但对成人结核病的预防效果在不同地区表现出极大差异(0~80%)。随着耐药和耐多药结核病的出现和流行率的增加,迫切需要开发更加理想的新型结核疫苗。引起结核病的主要病原菌结核分枝杆菌是胞内寄生菌,细胞免疫应答对机体抵抗此类胞内寄生菌的感染至关重要。开发出能诱导机体产生强的抗结核分枝杆菌的细胞免疫应答是目前该领域研究的一个主要方向。目前处于临床试验阶段的新型结核疫苗主要有减毒活疫苗、蛋白亚单位疫苗及病毒载体疫苗等三类。这些疫苗的选择的抗原主要是动物研究或人体试验中已经证实的可以产生较强免疫应答的分泌性蛋白,如TB10.4,ESAT6,MPT64,Ag85B和Ag85A等。上述疫苗尝试利用病毒或BCG表达抗原,或利用含有特定佐剂的重组蛋白作为免疫原诱导机体产生抗结核杆菌的细胞免疫应答。虽然抗结核疫苗研发取得了一些成果,但至今仍没有新的抗结核病疫苗产品上市。因此,本论文拟通过构建表达Ag85B-TB10.4融合蛋白的痘病毒(MVAH4)和腺病毒(Ad H4)疫苗、高表达Ag85B-TB10.4的痘病毒(MVATH4)疫苗和Ag85B/TB10.4-BLP蛋白亚单位疫苗,研究同源和异源病毒载体Prime-boost免疫方案、不同抗原表达能力的病毒载体、及BLP用作佐剂对抗结核疫苗的动物免疫效果,为新型抗结核疫苗的研发提供实验数据和理论依据。病毒载体疫苗能够诱导机体产生较强的细胞免疫应答。痘病毒(MVA)和腺病毒(Ad)载体是目前疫苗研发领域常用的两种病毒载体,在抗结核疫苗研发过程中具有重要的潜力。目前处于临床试验阶段的重组病毒载体抗结核疫苗中,多数采用单一重组病毒进行多次免疫的方案。而近些年的研究发现,采用不同病毒载体的prime-boost免疫方案,可以有效避免机体的抗载体免疫应答,从而提升疫苗的效果。因此,本研究构建了能表达Ag85B-TB10.4融合蛋白的MVAH4和Ad H4两种重组病毒载体结核疫苗,并研究了同源和异源prime-boost免疫方案产生的免疫应答的区别。Ad H4和MVAH4均能诱导小鼠产生免疫应答。含有Ad H4(Ad H4-Ad H4、Ad H4-MVAH4和MVAH4-Ad H4)的免疫方案诱导产生更高水平的抗原特异性抗体,产生更高水平的IFN-γ,以及更高比例的活化的CD8+T细胞(CD69+CD8+T细胞)。并且不同的免疫方案都诱导产生比较均衡的Th1和Th2免疫应答。Ad H4-MVAH4免疫组的脾细胞在Ag85B蛋白的MHC-I表位肽的刺激下,产生分泌IFN-γ的脾细胞数量明显多于其他免疫组。此外,Ad H4-MVAH4免疫组分泌Th1相关细胞因子(IFN-γ和TNF-α)的水平也明显高于其他组。这些结果说明,包含Ad H4的免疫方案与只含有BCG或MVAH4的免疫方案相比,可以更有效的诱导体液和细胞免疫应答。此外,Ad H4-MVAH4的免疫方案可能会产生更理想的保护效果。Ad H4-Ad H4或MVAH4-MVAH4同源prime-boost免疫结果显示,在免疫剂量相同的情况下,MVAH4诱导的免疫应答明显弱于Ad H4。为了解决这一问题,本研究尝试在抗原蛋白N端基因加上了t PA信号肽序列,构建得到了MVATH4重组病毒结核疫苗。经过Western Blot验证,相对于MVAH4,MVATH4感染细胞后,表达的抗原蛋白显著上升。将MVATH4免疫小鼠后,检测免疫应答发现,相比于MVAH4组,MVATH4免疫诱导的抗体水平,细胞因子分泌水平以及活化T细胞的比例均有显著升高,同时没有改变Th1和Th2的应答倾向。除了免疫原和免疫方案外,佐剂也是影响疫苗效果的关键因素。目前几种处于临床试验阶段的蛋白亚单位结核疫苗采取的方案是将抗原蛋白与激活TLR4或TLR9途径的佐剂进行混合,免疫诱导产生抗原特异性的细胞免疫应答。然而有研究表明,结核分枝杆菌在感染细胞后,会表达一系列TLR2的配体成分。这些TLR2激活剂在诱导免疫系统产生抗结核的免疫应答方面发挥了重要作用。细菌样颗粒(BLP)是由食品行业常用的乳酸乳球菌经酸处理制备的肽聚糖壳,临床实验证明BLP是具有良好的安全性。以往的研究中证实,用乳酸乳球菌制备的BLP是TLR2激活剂,它不与TLR3、4、5、7、8和9相互作用。本研究使用BLP颗粒作为佐剂,将Ag85B和TB10.4蛋白通过PA与BLP连接,通过肌肉注射途径免疫小鼠。对免疫小鼠后的免疫应答进行检测发现,虽然蛋白+BLP免疫组诱导的特异性抗体水平及细胞因子的分泌水平均高于蛋白免疫组,但诱导的仍主要是体液免疫应答,并且其诱导的Th1/Th2/Th17的应答模式与BCG免疫组并不相同。综上所述,本研究首先构建了表达Ag85B-TB10.4融合蛋白的MVAH4和Ad H4病毒载体疫苗,并评价了两种疫苗在不同免疫方案下诱导的免疫应答反应。接着,构建了加入t PA信号肽序列的MVATH4,并验证了疫苗诱导的免疫应答的增强。此外,我们使用BLP作为蛋白疫苗佐剂,但免疫小鼠后并未有效的诱导细胞免疫应答。本研究主要从免疫原性方面对不同的疫苗进行了探讨,更深入的应答机制以及疫苗保护力需要更进一步的研究。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392
【部分图文】：

1.1.1 结核病结核病已经存在了数千年，至今仍是全球健康面临的一个主要问题。结核病每年可造成数百万人的健康问题。尽管经过及时的诊断和正确的治疗，结核病可以被治愈，其仍是世界十大死亡原因之一，导致的死亡数目排在艾滋病之上。据世界卫生组织的统计[1]，2016 年因结核病死亡的人数为 170 万，其中 40万因结核病死亡的人是艾滋病患者。经过评估，2016 年大约有 1040 万的结核病新增病例，其中五百九十万是男性，三百五十万是女性，还有一百万是儿童。总体而言，90%的病例为成年人，10%的病例为儿童，男女比例为 1.6：1。大部分的新发病例在亚洲（61%）和非洲（26%）地区，少部分在中东（7%），欧洲（3%）和美国（3%）。30 个高负担国家覆盖了 87%的新发病例，其中印度，中国，印度尼西亚三个国家就覆盖了全球 45%的新发病例。而不同国家的发病率也差异很大，具体分布如图 1.1 所示。

几种与其密切相关的菌也会引起疾病,其中包括非洲分枝杆菌anum）和牛分枝杆菌（M. bovis）。虽然在分枝杆菌属中有数以百计的其但大多数是环境腐生物种，它们要么是非致病菌（例如耻垢分枝杆菌matis）），要么是机会致病菌（例如鸟分枝杆菌（M. avium）和龟分枝杆nae））。结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和牛分枝杆菌是能够具有正常免个体中引起疾病的病原菌。其致病性的原理目前仍是研究的热点，并且楚结核分枝杆菌具有独特的毒力因子, 能够躲过宿主免疫进而引起疾1883 年，Robert Koch 通过发现结核组织中的“抗酸”杆菌（能够在酸性后仍保持颜色），首次鉴定出结核分枝杆菌是结核病的致病菌。此后不生物就在简单的肉汤培养基中得到培养生长。结核分枝杆菌的一个不寻是它的生长速度很慢（约 24 小时复制一代）。因此, 通常需要花费数个证明其生长。结核分枝杆菌和相关分枝杆菌生长缓慢的原理目前仍不

吉林大学博士学位论文肉芽肿形成部位会有新的毛细血管产生，推测新生血管提供额外的氧气和营养来源，有利于分枝杆菌复制[7]。在小鼠模型中，在肉芽肿位置，M.tb 最先感染树突状细胞，然后在诱导产生适应性免疫应答之前招募巨噬细胞和嗜中性粒细胞。在 C57BL/6 小鼠模型中发现，在肉芽肿部位缺乏氧气，而在人体中，肉芽肿通常被表征为缺氧和营养缺乏的干酪样坏死性中心[8]。
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本文编号：2852899