S5a诱导THP-1细胞分化的胞内机制研究

发布时间：2020-10-23 10:15

　　 Angiocidin是从肺癌细胞中分离到的一种蛋白质，它可以诱导人单核白血病细胞THP-1分化为巨噬细胞，前期有研究指出MAPK、NF-κB与PI3K通路介导了这一效应。S5a是细胞26S蛋白酶体的亚单位，它在氨基酸序列上与Angiocidin高度一致，本科室前期研究表明，S5a亦可以促进THP-1分化为巨噬细胞。S5a通过结合细胞膜死亡受体6（DR6）进而激活NF-κB信号通路，最终促进THP-1向巨噬细胞分化。尽管如此，S5a诱导THP-1分化的细胞内机制尚不清楚，究竟是哪些基因在这个过程中扮演关键节点基因（hub gene）的角色值得探究，又是何种分子将NF-κB通路激活这一信号进一步向下游传导，直至开启细胞分化之门仍旧未知。本文从下述两个方面，阐述S5a诱导THP-1分化的细胞内机制。第一部分S5a诱导THP-1细胞分化的关键节点基因研究 为了探讨哪些基因是S5a诱导THP-1细胞分化过程中的关键节点基因（hubgene），我们首先用重组的MBP-S5a诱导THP-1细胞12h，同时MBP处理的THP-1细胞作为对照组。随后，我们采用Affymetrix芯片去检测12h的实验组与对照组全基因表达情况，一共发现了994个差异表达的基因。我们利用这些差异表达基因进行了信号通路分析（pathway analysis），并发现总共存在20个有显著性差异的信号通路。这些通路富集了174个差异表达的基因。我们用这174个差异基因构建了基因与基因相互作用网络，并剔除了与其他基因几乎无相互作用的基因，最终得到包含102个差异基因的相互作用网络，我们认为该网络反映了S5a诱导THP-1分化的机制。通过对该网络中的所有基因按度值进行排序，我们最后确认了10个THP-1分化相关的关键节点基因，它们的度值排名网络前10位。第二部分S5a激活NF-κB通路并进一步启动THP-1细胞分化的信号转导研究 我们发现，在MBP-S5a诱导THP-1后，细胞中P65蛋白的磷酸化水平明显升高，这说明S5a激活了NF-κB信号通路。同样，我们使用商品化生物素标记的S5a诱导THP-1之后，NF-κB信号通路亦被激活。本科室前期研究发现，当使用NF-κB通路抑制剂预处理THP-1细胞后，再用S5a诱导，THP-1细胞增强的吞噬能力被显著削弱。我们还发现，当NF-κB通路被抑制后，S5a抑制THP-1生长及促进THP-1高表达炎症介质这两种效应同样被显著削弱。综上，我们推断S5a激活NF-κB信号通路并进一步介导THP-1分化。我们在mRNA和蛋白质水平均证明了S5a诱导THP-1之后转录因子wt1表达明显上调，当NF-κB通路被抑制后，这种上调也明显被抑制。当采用wt1干扰RNA成功地阻断S5a诱导的wt1表达上调后，S5a诱导的THP-1生长抑制及吞噬能力增强这两种效应被显著削弱。这说明S5a通过激活NF-κB通路上调wt1表达，从而介导THP-1分化。我们还发现，在S5a诱导THP-1分化的过程中，转录因子c-myb的表达在mRNA及蛋白质水平均显著下调。前期研究认为c-myb的高表达阻碍了单核细胞的分化，而它的下调是多种细胞分化的必需条件，我们的实验结果与理论预期一致。NF-κB抑制剂预处理细胞后，即使有S5a诱导，c-myb也不再明显下调。之后，我们使用wt1干扰RNA成功阻断S5a诱导的wt1上调后，c-myb表达的下调也明显受到抑制，而染色体免疫共沉淀（ChIP）实验表明了S5a处理THP-1细胞后，wt1转录因子确实结合在c-myb基因启动子区域“cgcccccgc”序列上，既往研究表明wt1可结合在此序列上抑制c-myb的转录，结合我们的实验结果和前期研究，我们认为S5a激活NF-κB通路后，wt1表达上调并进一步抑制了c-myb基因的转录，从而为细胞分化克服了障碍，启动了THP-1分化。 此研究在本课题组前期研究的基础上，更全面深入地揭示了S5a诱导THP-1分化的细胞内机制，找到了若干可能发挥重要作用的关键节点基因，阐明了S5a诱导NF-κB信号通路激活后又是如何进一步转导信号并最终启动THP-1细胞分化的机制。本研究将为单核细胞白血病的诱导分化治疗以及炎症性疾病的抗炎治疗提供新的药物设计靶点参考，并且将我们对单核细胞向巨噬细胞分化机制的认识进一步地加深。
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R3411
【部分图文】：

-S5a处理THP-1细胞48小时，平行地设立胞吞噬实验来检测THP-1细胞的吞噬能了明显增强，S5a组吞噬细胞的百分比较两个组，处理24小时后行实时荧光定量重要炎症介质的表达水平，结果证明在显著升高（图2），这个结果从高表达炎功诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞。随，单纯MBP标签来做对照，于48小时的影响，结果表明S5a处理组较对照组相（图3），一般说来，幼稚的原始细胞往细胞其增殖能力则相对弱很多，从细胞了THP-1细胞的分化。综上所述，本实化为巨噬细胞。MBP-S5a MBP

- 26 -图 7 S5a 诱导 THP-1 细胞分化过程中基因相互作用网络我们利用上述差异表达基因构建了基因与基因相互作用网络，并剔除了与其他基因均无相互作用的基因，最终得到了包含 102 个基因的相互作用网络图。图中红色的基因为上调基因，蓝色的基因为下调基因，箭头表示二者之间的相互作用，由调控基因指向靶基因。相互作用的具体形式包括磷酸化、激活表达等等。

纯 MBP 对照组持续并且显著升高。这同时说明了 S5a 处理 THP-1 细胞后激活了 NF-κB 信号通路。图9 生物素标记的S5a诱导THP-1细胞后P65蛋白的磷酸化水平较阴性对照组持续显著升高我们使用商品化的生物素标记 S5a 处理 THP-1 细胞，并于处理后 1 小时、6 小时和 12 小时抽提蛋白质行 western-blot 实验，检测总 P65 蛋白的水平和磷酸化 P65 蛋白的水平，结果表明两组中总 P65 蛋白水平几乎无差异，但 S5a 诱导 THP-1 细胞后 P65 蛋白的磷酸化水平较阴性对照组持续并显著升高。这同时说明了 S5a 处理 THP-1 细胞后激活了 NF-κB 信号通路。（二）NF-κB 信号通路的激活介导了 S5a 诱导 THP-1 细胞分化过程中的生长抑制现象
【参考文献】

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1 杨璐;曹悦鞍;彭朝胜;夏菁;张文洛;田力;;Wt1反义寡核苷酸阻断白血病微小残留病wt1基因表达的体外研究[J];中国实验血液学杂志;2011年01期

2 孟月生,MD Minden;WT1基因转染抑制白血病细胞生长和集落形成并促进细胞分化[J];中华血液学杂志;2003年05期

3 卢青,刘革修,欧大明,曾高峰;WT-1通过下调c-myb表达抑制U937细胞增殖[J];中国现代医学杂志;2000年05期

本文编号：2852901