Drp1与BAX共定位线粒体调节皮层神经元凋亡损伤的作用
发布时间：2020-11-06 00:45
目的:探讨Drp1与BAX共定位线粒体调节皮层神经元凋亡损伤的作用。材料与方法:体外培养新生24h内SD大鼠皮层神经元,分为空白组(A组)、DMSO溶剂组(B组)、谷氨酸钠组(C组)、Mdivi-1预处理+谷氨酸钠组(D组),beta III tubulin和MAP2荧光检测鉴定神经元,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,Western Blot分别分析皮层神经元全细胞提取液、胞质内及线粒体内细胞色素C、Casapse-3、Drp1、p-Drp1、BAX的表达情况,免疫荧光染色检测Drp1和BAX的表达及其与线粒体位置关系。结果:Beta III tubulin和MAP2荧光结果清晰显示了神经元的特有形态;JC-1染色结果显示,A、B组之间线粒体膜电位没有明显区别,与之相比,C、D组的线粒体膜电位降低明显,C组尤其明显。Westen blot结束示:全细胞提取液中C组BAX、Drp1、Caspase-3明显增加且D组增加程度不如C组明显,p-Drp1与Drp1的变化趋势相反;胞质内C、D组中BAX、Drp1、Cyto-C明显增加且C组为著,p-Drp1与Drp1的变化趋势相反;线粒体提取液中C和D组BAX和Drp1明显增加且C组更为明显,A、B、C、D四组的p-Drp1表达量均很低,C和D组Cyto-C明显减少且C组更为明显。Drp1和BAX的荧光结果显示,荧光强度的变化趋势与Westen blot定量结果的变化趋势一致,且随着Drp1和BAX表达增加,两者共定位于线粒体趋势更为明显。结论:线粒体膜是动态变化的结构,线粒体作为细胞重要的细胞器之一,为细胞提供能量,其结构完整与功能正常对维持细胞稳态至关重要。神经元凋亡损伤过程中,BAX表达增加,p-Drp1去磷酸化为Drp1,BAX和Drp1共同聚集于线粒体,增加线粒体膜通透性,促进线粒体分裂,降低线粒体膜电位,促进Cyto-C从线粒体释放并激活Caspase-3介导细胞凋亡。Mdivi-1可以抑制p-Drp1的去磷酸化以及Drp1和BAX共定位,对谷氨酸介导的神经毒性起保护作用,稳定线粒体膜电位,抑制线粒体内Cyto-C的释放及对Caspase-3的激活,抑制神经元凋亡损伤。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R338
【部分图文】：
图 1.免疫荧光染色神经元鉴定（7d），细胞胞体饱满，神经元突触明显且相互交织构成神经元网络，microtubule-associated protein 2（MAP2）（A1、A2、A3）和 beta III tubulin （B1、B2、B3）。图 A1 (200×)， A2 (400×)， A3 (400×).MAP2 (红)， DAPI (蓝). B1 (200×)， B2 (400×)， B3 (400×). Beta III tubulin(红)， DAPI (蓝)。2 线粒体膜电位检测细胞分组处理后，JC-1 探针观察线粒体膜电位，JC-1 探针有两种存状态，聚合体和单体形态，线粒体膜电位正常是，JC-1 以聚合体形式存在，发出红色的荧光，而当线粒体受凋亡因子刺激下，线粒体膜电位下降，JC-1 探针以单体形式发出绿色荧光，与 A、B 组相比，C、D 组细胞 Monomer 特有的绿色荧光明显增强，尤以 C 组为著。谷氨酸诱导神经元凋亡，线粒体膜内外的电位势能无法维持正常，而使用 Drp1 的抑制剂 Mdivi-1 可以抑制线粒体分裂，能够减轻谷氨酸盐对线粒体膜电位的影响（图 2）。
图 2.线粒体膜电位：JC-1 为荧光探针，可以快速、灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，能够用于早期的细胞凋亡检测。JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm 的理想荧光探针，在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体基质中，聚合物可以产生明亮的红色荧光；线粒体膜电位较低时，JC-1 不能以聚合物形式存在于线粒体基质，单体形式的 JC-1(monomer)可以产生绿色荧光。荧光颜色的变化可以直观体现出线粒体膜电位的变化，线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。3 免疫印迹法检测相关蛋白表达结果3.1 谷氨酸盐激活 Drp1 并促进其向线粒体募集谷氨酸盐能够加速 p-Drp1 (Ser637)去磷酸化，并且可以促进 Drp1 向线粒体募集，Drp1 是经典的调节线粒体分裂的蛋白，生理状态下以无活性的 637 位点磷酸化形式存在于胞质内，随着细胞内环境改变，功能 Drp1 和 p-Drp1 (Ser637
图 4.1.COX IV 做为线粒体的 Maker，用于标记线粒体的位置，红色荧光为 Drp1，黄色荧光为两者 Merge 点，蓝色为 DAPI，黄色荧光表示募集于线粒体的 Drp1。COX IV BAX DAPI Merge MergeABC
【参考文献】
本文编号：2872425
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R338
【部分图文】：
图 1.免疫荧光染色神经元鉴定（7d），细胞胞体饱满，神经元突触明显且相互交织构成神经元网络，microtubule-associated protein 2（MAP2）（A1、A2、A3）和 beta III tubulin （B1、B2、B3）。图 A1 (200×)， A2 (400×)， A3 (400×).MAP2 (红)， DAPI (蓝). B1 (200×)， B2 (400×)， B3 (400×). Beta III tubulin(红)， DAPI (蓝)。2 线粒体膜电位检测细胞分组处理后，JC-1 探针观察线粒体膜电位，JC-1 探针有两种存状态，聚合体和单体形态，线粒体膜电位正常是，JC-1 以聚合体形式存在，发出红色的荧光，而当线粒体受凋亡因子刺激下，线粒体膜电位下降，JC-1 探针以单体形式发出绿色荧光，与 A、B 组相比，C、D 组细胞 Monomer 特有的绿色荧光明显增强，尤以 C 组为著。谷氨酸诱导神经元凋亡，线粒体膜内外的电位势能无法维持正常，而使用 Drp1 的抑制剂 Mdivi-1 可以抑制线粒体分裂，能够减轻谷氨酸盐对线粒体膜电位的影响（图 2）。
图 2.线粒体膜电位：JC-1 为荧光探针，可以快速、灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，能够用于早期的细胞凋亡检测。JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm 的理想荧光探针，在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体基质中，聚合物可以产生明亮的红色荧光；线粒体膜电位较低时，JC-1 不能以聚合物形式存在于线粒体基质，单体形式的 JC-1(monomer)可以产生绿色荧光。荧光颜色的变化可以直观体现出线粒体膜电位的变化，线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。3 免疫印迹法检测相关蛋白表达结果3.1 谷氨酸盐激活 Drp1 并促进其向线粒体募集谷氨酸盐能够加速 p-Drp1 (Ser637)去磷酸化，并且可以促进 Drp1 向线粒体募集，Drp1 是经典的调节线粒体分裂的蛋白，生理状态下以无活性的 637 位点磷酸化形式存在于胞质内，随着细胞内环境改变，功能 Drp1 和 p-Drp1 (Ser637
图 4.1.COX IV 做为线粒体的 Maker，用于标记线粒体的位置，红色荧光为 Drp1，黄色荧光为两者 Merge 点，蓝色为 DAPI，黄色荧光表示募集于线粒体的 Drp1。COX IV BAX DAPI Merge MergeABC
【参考文献】
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2 Maya Otto-Duessel;Ben Yi Tew;Steven Vonderfecht;Roger Moore;Jeremy O Jones;;Identification of neuron selective androgen receptor inhibitors[J];World Journal of Biological Chemistry;2017年02期
本文编号：2872425
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