从单个兔B细胞获得抗人cGAS蛋白单克隆抗体
【部分图文】：
??甲芟赴???30.6%;最后在第四个象限圈出P5，P5是P4门的子门，即CD4-/CD8-/Tlymphosite-/IgM-/IgG+/anti-cGAS+B细胞，P5中有127个细胞，占总细胞数的0.9%．通过分析之后的结果进行分选，最终将P5的细胞从流式细胞仪中分选出来，约占所有PBMC的1.3%．2.2兔抗体重链和轻链可变区序列的获得将单个B细胞进行ＲNA提取，cDNA反转录后，用设计和整理的一套巢式扩增引物对cDNA进行扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示经过两轮PCＲ后，均能获得目的大小的条图2流式分选术分选CD4-/CD8-/Tlymphosite-/IgM-/IgG+/anti-cGAS+B细胞Fig.2CellsortingofCD4-/CD8-/Tlymphosite-/IgM-/IgG+/anti-cGAS+BcellsbyFACS带，结果见图3．将其割胶回收，重链可变区克隆于PFUSEss-CHIg-rG-03，轻链可变区克隆于PFUSE2ss-CLIg-rk1质粒，通过Sanger测序，验证抗体序列的重链和轻链信息．得到24个B细胞的重链和轻链可变区序列信息，以克隆23测序数据为例，其使用IMGT数据库(http:∥www.imgt.org/)可以比对到一个抗体的重链和轻链的可变区序列信息，其中重链氨基酸序列比对信息显示:V区使用的是胚系IGHV1S7*01基因，D区基因使用的是IGHD2-1*01;J区基因使用的是胚系IGHJ4*01基因，结果见表1;而轻链基因比对信息显示:V区基因使用的是胚系IGKV1S37*01基因，J区使用的是胚系IGKJ1-2*01基因，结果见表2．图3单个B细胞使用重轻链引物扩增的第二轮PCＲ结果Fig.3SecondＲoundPCＲproductsofVH，V-KAPPAdomaingenesfromsingleBcell表1克隆23中兔Ig重链可变区胚系基因Tab.1Ｒabbitgerm
第6期傅雅娟，等:从单个兔B细胞获得抗人cGAS蛋白单克隆抗体2.3抗人cGAS抗体的表达及鉴定将重组重链表达载体和轻链表达载体匹配，转染293T细胞表达抗体，收取细胞上清检测抗体效价，结果见图4．结果显示24个抗体中，克隆19，20，21，22，23能特异性和人cGAS(161－522)蛋白结合．为进一步确定抗体效价，将抗体克隆23进行梯度稀释，结果见图5，ELISA结果检测发现抗体克隆23滴度达到在1∶10000，具有良好的活性．图4ELISA测定细胞上清表达抗体效价Fig.4MeasurementofantibodyserumtiterofcellculturemediumbyELISA图5ELISA检测B细胞克隆23的抗体效价Fig.5MeasurementantibodytiterofBcellclone23byELISA3讨论从兔外周血B细胞中筛选兔单克隆抗体的技术，较传统杂交瘤方法具有明显的优势．使用单B细胞技术扩增单克隆抗体，可省略B细胞扩增培养的时间，更快速地获得有效的抗体;同时也极大的节约成本．该方法不依赖于饲养细胞，因此它不仅可应用于兔外周血B细胞，还可以应用于多个物种，包括小鼠、人类等［25］．单个B细胞抗体技术制备技术已经成为制备抗体的热门方法．随着B细胞的分选技术、PCＲ扩增方法以及抗体特异性、亲和力鉴定方法的成熟和完善，未来单个B细胞抗体制备技术将在诊断、临床应用中发挥重大的作用．环状GMP-AMP合成酶(cyclicGMP-AMPsynthase，cGAS)是细胞内重要的DNA感受器，可激活下游的炎症通路．最近研究表明，用依托泊苷(etoposide)、喜树碱(camptothecin)和过氧化氢(H2O2)三种药物处理三种人成纤维细胞?
cGAS抗体的表达及鉴定将重组重链表达载体和轻链表达载体匹配，转染293T细胞表达抗体，收取细胞上清检测抗体效价，结果见图4．结果显示24个抗体中，克隆19，20，21，22，23能特异性和人cGAS(161－522)蛋白结合．为进一步确定抗体效价，将抗体克隆23进行梯度稀释，结果见图5，ELISA结果检测发现抗体克隆23滴度达到在1∶10000，具有良好的活性．图4ELISA测定细胞上清表达抗体效价Fig.4MeasurementofantibodyserumtiterofcellculturemediumbyELISA图5ELISA检测B细胞克隆23的抗体效价Fig.5MeasurementantibodytiterofBcellclone23byELISA3讨论从兔外周血B细胞中筛选兔单克隆抗体的技术，较传统杂交瘤方法具有明显的优势．使用单B细胞技术扩增单克隆抗体，可省略B细胞扩增培养的时间，更快速地获得有效的抗体;同时也极大的节约成本．该方法不依赖于饲养细胞，因此它不仅可应用于兔外周血B细胞，还可以应用于多个物种，包括小鼠、人类等［25］．单个B细胞抗体技术制备技术已经成为制备抗体的热门方法．随着B细胞的分选技术、PCＲ扩增方法以及抗体特异性、亲和力鉴定方法的成熟和完善，未来单个B细胞抗体制备技术将在诊断、临床应用中发挥重大的作用．环状GMP-AMP合成酶(cyclicGMP-AMPsynthase，cGAS)是细胞内重要的DNA感受器，可激活下游的炎症通路．最近研究表明，用依托泊苷(etoposide)、喜树碱(camptothecin)和过氧化氢(H2O2)三种药物处理三种人成纤维细胞，均发现DNA损伤可使cGAS核转位增加．Co-IP实验提示cGAS的核转位可能
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