SjDLC和SjCB2 DNA疫苗及IFN-γ在日本血吸虫感染中的保护性作用

发布时间：2017-04-06 21:05

  本文关键词：SjDLC和SjCB2 DNA疫苗及IFN-γ在日本血吸虫感染中的保护性作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]本实验通过构建血吸虫核酸疫苗加IFN-γ联合免疫小鼠,探讨联合疫苗pcDNA3.1(-)/SjDLC+pcDNA3.1(+)SjCB2及IFN-γ在日本血吸虫感染中的免疫保护性作用。[方法]利用PCR法,获取SjDLC,mIFN-γ基因,并构建pcDNA3.1(-)/SjDLC,pcDNA 3.1(+)/m IFN-γ重组质粒,双酶切及测序鉴定。将两种质粒分别转染至Hela细胞,Western blot鉴定其表达。BALB/c小鼠分为7组,分别为:PBS(A组)、pcDNA3.1(+)(B组)、pcDNA3.1(+)/mIFN-γ(C组)、pcDNA3.1(+)/SjCB2(D组)、pcDNA3.1(-)/SjDLC(E组)、pcDNA3.1(+)/SjCB2+pcDNA 3.1(-)/SjDLC(F组)、pcDNA3.1(+)/SjCB2+pcDNA3.1(-)/SjDLC+pcDNA3.1(+)/mIFN-γ(G组)。按照分组用核酸疫苗免疫小鼠,每两周免疫一次,共三次。末次免疫2周后,PCR法和免疫组化法检测小鼠肌肉中SjDLC,SjCB2,IFN-γ基因及表达。同时,对各组小鼠用血吸虫尾蚴进行攻击感染,分别在感染第0w、2w、4w、6w、8w及10w麻醉处死小鼠,收集血液、脾脏和肝脏组织进行实验。HE和Masson染色观察小鼠肝脏病理变化;流式细胞术检测小鼠肝脏、脾脏Th1和Th2细胞比例;ELISA检测IFN-γ、IL-4、IgG、IgE水平。取感染第6w小鼠计算减虫率、减卵率。[结果]Western blot显示SjDLC,IFN-γ能在HeLa细胞中表达。核酸疫苗第三次免疫BALB/c小鼠2周后,能从小鼠肌肉组织中扩增出SjCB2、SjDLC和mIFN-γ基因及观察到三个基因的表达。HE和Masson染色显示:血吸虫感染第6w后,虫卵肉芽肿及纤维化等病变以pbs组(a组)和pcdna3.1(+)组(b组)最为严重,且随着感染时间的延长病变加重。c、d、e、f、g组病变程度明显轻于a、b组,g组病变程度最轻。流式细胞术结果显示:血吸虫感染2w~4w,肝、脾组织中th1细胞比例均显著性高于未感染组(0w),p0.05,于感染第4w达峰值,c、d、e、f、g组显著性高于a、b组,p0.05,以g组th1比例最高,血吸虫感染第6w~10w,各组的th1细胞比例均显著性下降,但c、d、e、f、g组仍显著性高于a、b组,p0.05,以g组th1水平最高;血吸感染第6w~10w,各组的th2细胞比例均显著性升高,第8w达峰值;但c、d、e、f、g组th2均显著性低于a、b组,p0.05,以g组最低。细胞因子检测结果显示:各组ifn-γ水平与其th1细胞比例变化相一致;il-4水平与th2比例变化趋势一致。免疫后各核酸疫苗组igg显著性高于a、b、c组,p0.05,其中以g组抗体水平最高;尾蚴攻击感染各组小鼠后,igg抗体在感染第6周达峰值,与0w组比较,p0.05,各核酸疫苗组的抗体水平显著性高于a、b、c组,p0.05,其中以g组抗体水平最高。ige水平在核酸疫苗免疫小鼠后无显著性变化,但在尾蚴攻击感染后第6周显著性升高,第8周达峰值,各核酸疫苗组的ige水平显著高于a、b、c组,p0.05,以g、f组最高。减虫率和减卵率计算结果显示:各核酸疫苗组显著性高于a、b、c组,p0.05,其中以g组最高,分别为40.5%、55.7%。[结论]核酸疫苗免疫balb/c小鼠后能产生一定抗血吸虫感染作用,以联合疫苗加ifn-γ免疫效果最佳。
【关键词】：DNA疫苗 日本血吸虫 IFN-γ 联合免疫
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 常用的英文缩写11-15
• 第1章 绪论15-17
• 第2章 实验材料17-21
• 2.1 实验仪器设备17
• 2.2 实验动物与钉螺17-18
• 2.3 细胞18
• 2.4 菌种和载体18
• 2.5 主要实验试剂18-21
• 第3章 实验方法步骤21-41
• 3.1 SjDLC目的基因克隆和纯化21-24
• 3.2 重组真核质粒pcDNA3.1(-)/SjDLC的构建24-28
• 3.3 重组真核质粒pcDNA3.1(-)/SjDLC的表达28-30
• 3.4 小鼠IFN-γ基因克隆30-31
• 3.5 重组真核质粒pc DNA3.1(+)/m IFN-γ的构建31-32
• 3.6 重组真核质粒pcDNA3.1(+)/m IFN-γ的表达32
• 3.7 核酸疫苗疫苗接种及表达32-34
• 3.8 疫苗保护性作用的研究34-39
• 3.9 统计学方法处理数据39-41
• 第4章 实验结果41-69
• 4.1 真核质粒SjDLC构建与表达41-43
• 4.2 真核质粒m IFN-γ构建与表达43-44
• 4.3 真核质粒在动物体内的表达44-46
• 4.4 真核质粒的保护性效果46-69
• 第5章 讨论69-73
• 第6章 结论73-75
• 参考文献75-80
• 综述80-88
• 参考文献85-88
• 附录88-90
• 本研究受以下课题资助90-91
• 研究成果及论文91-92
• 致谢92

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本文编号：289658