MiR-125a-5p靶向APC激活经典WNT信号通路促进hiPSCs分化为多巴胺能神经前体细胞
发布时间：2020-12-15 10:01
第一部分:诱导性多能性干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经前体细胞及差异表达MicroRNAs的筛选目的:筛选出hiPSCs体外诱导分化为多巴胺能神经神经前体细胞过程中表达有差异的microRNAs,与经典WNT信号通路进行比对分析筛选到miR-125a-5p。方法:分组:1)实验组:LSB/SHH/FGF8b/CHIR99021+N2/B27诱导组;2)对照组:单纯N2/B27诱导组。在体外将hiPSCs向多巴胺能神经前体细胞方向进行诱导分化,免疫细胞化学、实时定量PCR（qRT-PCR）法检测hiPSCs向DA能神经前体细胞分化过程中不同阶段细胞:神经前体细胞标志物Nestin、底板细胞标志物Foxa2、DA能神经前体细胞标志物En1、神经元标志物Tuj1及DA能神经元标志物TH的表达。提取实验组hiPSCs、神经前体细胞、DA能神经前体细胞3个阶段的细胞的总RNA进行microRNAs高通量测序,筛选出差异表达的microRNAs,与经典WNT信号传导通路进行相关性分析筛选出适当的microRNA用于研究。结果:在诱导分化过程中,神经前体细胞（NPCs）阶段（诱导分化第7天）细胞基本...
【文章来源】：广州医科大学广东省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
hiPSCs向多巴胺能前体细胞诱导分化光镜下细胞形态图：A.hiPSCs克隆；riment
23第一部分：诱导性多能性干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经前体细胞及miR-125a-5p的筛选3.2诱导分化第7天神经干细胞阶段免疫细胞化学和qRT-PCR检测结果对分化至第7天的细胞进行神经干细胞标志物NESTIN与底板神经前体细胞标志物FOXA2的免疫细胞化学检测，结果显示：实验组（Experiment）和对照组（Control）NESTIN+细胞（红色）数量无明显差异，但FOXA2+细胞（绿色）实验组较对照组明显增多（图2A）。提取两组细胞总RNA进行qRT-PCR检测，结果显示实验组细胞NESTIN的mRNA表达较对照组无明显差异（P>0.05），而实验组的FOXA2的mRNA表达较对照组明显增高（图2B）(P<0.001)。BFOXA2NESTIN图2:诱导分化第7天神经干细胞阶段相关基因的免疫细胞化学及qRT-PCR检测结果。A.对照组与实验组hiPSCs诱导分化第7天Nestin/FOXA2免疫荧光染色（标尺=100μm）。B.对照组与实验组hiPSCs诱导分化第7天NESTIN和FOXA2的mRNA表达。（***P<0.001）。AControlExperimentControlExperiment
25第一部分：诱导性多能性干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经前体细胞及miR-125a-5p的筛选B图3:诱导分化第25天神经元阶段相关基因的免疫细胞化学及qRT-PCR检测结果。A.对照组与实验组TH(红色)与TUJ1（绿色）免疫荧光染色（标尺=50μm）。B.分化第25天的两组细胞相关基因mRNA表达量比较。（*P<0.05;**P<0.01）。3.4HiPSCs向多巴胺能神经前体细胞诱导分化过程中不同阶段细胞microRNAs的高通量测序对拟进行高通量测序的RNA样品进行RNA完整性的检测，结果显示各组RNA的5S表达量不高，条带不明显，18S和28S均显示有明显条带，且28S比18S的表达量高。这表明样品RNA没有被降解，完整性良好（图4A）。0天hiPSCs（S01）、实验组7天NSCs(S02)及实验组25天DA能神经前体细胞(S03)经过microRNAs高通量测序分析后，筛选出差异有统计学意义的递增表达的miRNAs（图4B）。AControlExperiment
【参考文献】：
期刊论文
[1]Mir-125a与相关疾病关系的研究进展[J]. 范忠义,焦顺昌. 解放军医学院学报. 2015(11)
[2]The Functions of MicroRNAs and Long Non-coding RNAs in Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells[J]. Wenwen Jia,Wen Chen,Jiuhong Kang. Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2013(05)
本文编号：2918090
【文章来源】：广州医科大学广东省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
hiPSCs向多巴胺能前体细胞诱导分化光镜下细胞形态图：A.hiPSCs克隆；riment
23第一部分：诱导性多能性干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经前体细胞及miR-125a-5p的筛选3.2诱导分化第7天神经干细胞阶段免疫细胞化学和qRT-PCR检测结果对分化至第7天的细胞进行神经干细胞标志物NESTIN与底板神经前体细胞标志物FOXA2的免疫细胞化学检测，结果显示：实验组（Experiment）和对照组（Control）NESTIN+细胞（红色）数量无明显差异，但FOXA2+细胞（绿色）实验组较对照组明显增多（图2A）。提取两组细胞总RNA进行qRT-PCR检测，结果显示实验组细胞NESTIN的mRNA表达较对照组无明显差异（P>0.05），而实验组的FOXA2的mRNA表达较对照组明显增高（图2B）(P<0.001)。BFOXA2NESTIN图2:诱导分化第7天神经干细胞阶段相关基因的免疫细胞化学及qRT-PCR检测结果。A.对照组与实验组hiPSCs诱导分化第7天Nestin/FOXA2免疫荧光染色（标尺=100μm）。B.对照组与实验组hiPSCs诱导分化第7天NESTIN和FOXA2的mRNA表达。（***P<0.001）。AControlExperimentControlExperiment
25第一部分：诱导性多能性干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经前体细胞及miR-125a-5p的筛选B图3:诱导分化第25天神经元阶段相关基因的免疫细胞化学及qRT-PCR检测结果。A.对照组与实验组TH(红色)与TUJ1（绿色）免疫荧光染色（标尺=50μm）。B.分化第25天的两组细胞相关基因mRNA表达量比较。（*P<0.05;**P<0.01）。3.4HiPSCs向多巴胺能神经前体细胞诱导分化过程中不同阶段细胞microRNAs的高通量测序对拟进行高通量测序的RNA样品进行RNA完整性的检测，结果显示各组RNA的5S表达量不高，条带不明显，18S和28S均显示有明显条带，且28S比18S的表达量高。这表明样品RNA没有被降解，完整性良好（图4A）。0天hiPSCs（S01）、实验组7天NSCs(S02)及实验组25天DA能神经前体细胞(S03)经过microRNAs高通量测序分析后，筛选出差异有统计学意义的递增表达的miRNAs（图4B）。AControlExperiment
【参考文献】：
期刊论文
[1]Mir-125a与相关疾病关系的研究进展[J]. 范忠义,焦顺昌. 解放军医学院学报. 2015(11)
[2]The Functions of MicroRNAs and Long Non-coding RNAs in Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells[J]. Wenwen Jia,Wen Chen,Jiuhong Kang. Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2013(05)
本文编号：2918090
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